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瘦素(leptin)是肥胖基因(ob)的编码产物，为16 kDa的亲水性多肽，在哺乳动物中主要由脂肪组织合成，而在鱼类中主要在肝脏产生。成熟的leptin进入血液，在中枢神经系统和外周组织中发挥作用，参与机体的多种生物学功能，包括摄食调节、能量平衡、生长、生殖、免疫和骨代谢等。研究表明，leptin必须通过与leptin受体(leptin receptor，LepR)结合，才能发挥调节作用。 LepR是一种跨膜受体，属于Ⅰ类细胞因子受体家族，广泛分布于动物机体的中枢神经系统及外周组织中，通过mRNA的可变剪接和/或蛋白酶水解作用产生了多种LepR亚型，鱼类中最早由Wong等人在海洋青鲻(Oryzias melastigma)中克隆了长型LepR的cDNA序列。截至目前，在鱼类中被发现的LepR大多只有一种，只在大西洋鲑鱼、鲫鱼、虹鳟鱼和罗非鱼中克隆出了受体的不同亚型。本实验室已经从鲫鱼中克隆了三种LepR亚型的eDNA序列，分别是长型受体cclpr-L、几乎不含胞内区的“无尾”短型受体cclpr-S1、不含跨膜区的短型受体cclpr-S2（推测编码可溶性受体）。目前关于鱼类可溶性LepR的研究还很少。 本研究从蛋白水平进一步对鲫鱼cclpr-S2进行检测与分析，比较cclpr-S2与leptin-a和leptin-b的结合能力差异;并构建cclpr-S1、cclpr-L的真核荧光蛋白载体，为以后研究cclpr-S1的内化以及cclpr-L与cclpr-S1的异二聚体化等问题打下基础。 1.通过RT-PCR和RACE技术，扩增获得leptin-b的完整的编码区和3UTR，系统进化树分析表明鲫鱼leptin-b与建鲤同源性最高，两者再与草鱼汇成一支，最终与斑马鱼汇成一支。 2.为了在蛋白水平上检测并分析血清中cclpr-S2与leptin-a、leptin-b的结合差异，以进一步了解leptin-a、leptin-b的不同功能。我们首先构建重组表达载体pET32-leptin-b，在25℃、0.1 mM IPTG条件下诱导表达pET32-leptin-a和pET32-leptin-b，并用镍柱进行纯化;提取鲫鱼血清进行pull-down实验，发现与Trx-leptin-b相比，鲫鱼血清中的cclpr-S2更容易被Trx-leptin-a所吸附，说明leptin-a与cclpr-S2的结合能力比leptin-b强，推测leptin-a可能是LepR的主要配体。 3.构建真核荧光蛋白载体 pcDNA3.1-cclpr-S1-eGFP、pcDNA3.1-cclpr-S1-eYFP、 pcDNA3.1-cclpr-S1-eCFP、 pcDNA3.1-cclpr-L-eYFP、pcDNA3.1-cclpr-L-eCFP，然后对pcDNA3.1-cclpr-S1-eGFP提取质粒，进行Hela细胞的瞬时转染。