研究背景帕金森病(Parkinsonsdisease，PD)是好发于中老年人第二位最常见的中枢神经系统退行性疾病，其病因及发病机制目前尚不完全清楚。近年的研究表明PD患者脑内有具有强烈的小胶质细胞(Microglia，Mic)活化反应，PD患者脑中Mic的激活不是一种广泛性的炎症反应，而是在特定的区域具有特定的病理结局，与中脑黑质多巴胺能(Dopamine，DA)神经元的死亡具有密切联系。其主要依据有：1)人脑的免疫豁免是相对的，激活状态的Mic是脑内最重要的免疫活性细胞，是中枢神经系统内的巨噬细胞，对调控CNS免疫反应起到关键性的核心作用，Mic的活化被认为是大脑炎症最为敏感的标志。2)正常大脑内，中脑黑质区特别富含Mic，其含量是邻近腹侧被盖区的5倍，相一致的是PD患者中脑边缘系统DA能神经元死亡的严重程度远低于中脑黑质，而在黑质致密斑(SNpc)中，Mic反应在神经元变性最明显的亚带也最为显著。3)在MPTP模型、6-OADA模型以及鱼藤酮模型等PD动物模型上均已发现黑质Mic的激活先于DA能神经元的丢失，其活化程度与该部位DA能神经元的选择性死亡成正比，提示Mic激活在PD的发病机制中具有异乎寻常的作用。4)病理学研究发现DA能神经细胞浆中的路易氏小体或α-synuclein阳性物资经常被激活的Mic包围，可见PD的DA能细胞死亡与Mic活化直接相关。由此可见，在PD的病理过程中，中脑黑质Mic的活化并不是简单的“反应性增生”，而是深刻地参与到PD的发生、发展与结局过程中，因此探讨Mic激活对DA能神经元影响对进一步了解PD发病的炎性机制具有重要意义。 Mic激活后的许多蛋白和信号分子的异常表达具有“双刃”效应，在急性期或低水平的表达可以抵御病原体并促进组织修复，然而持续维持高水平的表达，其产生的自身毒性可以严重损害存活的宿主组织，出现继发的不可逆的神经元损害。PD时常可见到神经元和Mic之间膜的并置现象或密切接触，DA能神经元周围常有Mic的围绕。在激活的Mic所产生的一大类毒性因子中，一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)等被认为是两种细胞之间相互作用的重要信息分子，对神经元死亡具有关键性作用。许多实验与临床研究表明，细胞凋亡可能是PD多巴胺能神经元死亡的共同通路，Mic激活是否对凋亡过程有影响，目前尚未研究。因此深入探讨Mic激活产生DA能神经元毒性作用的分子机制，有助于阐明Mic激活是否有能力作为PD的启发因素引起DA能神经元的变性，抑或仅仅是其他因素导致DA能神经元的变性一种继发结果。 随着免疫反应和炎症过程在PD发病机制中有害作用的逐渐清晰，特别是Mic的作用，许多体内、离体或临床实验表明那些通过抑制Mic活化和干扰Mic产生毒性因子以控制免疫反应和炎症过程的药物，有希望减缓或阻止疾病进展，已成为PD治疗的一个新方向。Mic激活抑制剂美满霉素是一种广谱半合成的第二代四环素类抗生素，具有显著的抗炎、抗凋亡和抗氧化作用，近年来的研究表明美满霉素具有明显的神经保护作用，已被成功地应用于多种神经退行性病变的临床及实验研究，但其具体的分子机制尚未完全揭示。如能进一步对其保护DA能神经元的作用及其机制进行深入研究，对寻找一种新型有效的DA能神经元保护剂具有重要意义。 研究目的1、建立小胶质细胞激活介导DA神经元损伤的动物模型及细胞培养体系。 2、在体和离体研究LPS刺激后小胶质细胞激活的活化规律及其对DA神经元的毒性作用。 3、在体和离体研究小胶质细胞激活介导DA神经元损伤的分子机制。 4、在体和离体研究美满霉素对小胶质细胞激活的抑制及其对DA神经元的保护作用机制。 结果1LPS诱导DA能神经元损伤细胞模型的建立通过OX-42染色发现，在乳鼠原代中脑神经元和神经胶质细胞共培养体系中Mic为小圆形，OX-42表达水平较低；LPS诱导后细胞体积增大明显，为圆形或吞噬状，数量增多，OX-42表达水平上调，伴随的是神经元数目的减少，残存的神经元表现为突起广泛受损，变短、变细，严重时突起消失。LPS+Mino干预组细胞体积增大，多为圆形，吞噬状少见，残存的神经元数目较多。 2免疫组化染色检查中脑神经元和神经胶质细胞共培养体系中TH、Nurr1、iNOS、IL-1β、TNF-α、Caspase-3阳性细胞的表达。 在正常未予干预的共培养体系中具有丰富的TH、Nurr1阳性细胞表达及少量的iNOS、IL-1β、TNF-α、Caspase-3阳性细胞表达，LPS处理后的两组，可见TH、Nurr1阳性细胞均明显减少，iNOS、IL-1β、TNF-α、Caspase-3阳性细胞表达均明显增多，组间比较可见单纯LPS干预组TH、Nurr1阳性细胞下降程度高于LPS+Mino干预组，iNOS、IL-1β、TNF-α、Caspase-3阳性细胞增多程度高于LPS+Mino干预组。 3Western-blot检测中脑神经元和神经胶质细胞共培养体系中TH、OX-42、TNF-α、Nurr1蛋白的表达水平。 在正常未予干预的共培养体系中具有正常数量的TH、OX-42、Nurr1蛋白表达及少量的TNF-α蛋白表达，LPS处理后的两组可见TH、Nurr1蛋白表达明显减少，OX-42、TNF-α蛋白表达则明显增多，组间比较可见单纯LPS干预组与LPS+Mino干预组之间TH、OX-42、TNF-α、Nurr1蛋白的表达水平存在显著性差异。 4RT-PCR检测中脑神经元和神经胶质细胞共培养体系中TH、TNF-α、iNOS、IL-1β、Caspase-3等mRNA的表达含量。 在正常共培养体系中具有较多量的THmRNA表达及少量的TNF-α、iNOS、IL-1β、Caspase-3mRNA表达，LPS处理后的两组可见THmRNA表达明显减少，TNF-α、iNOS、IL-1β、Caspase-3mRNA表达则明显增多，组间比较可见单纯LPS干预组与LPS+Mino干预组之间TH、TNF-α、iNOS、IL-1β、Caspase-3mRNA的表达强度存在显著性差异。 第二部分在体研究Mic激活在PD中的作用及美满霉素对DA能神经元的保护机制 结论1.本实验成功建立了LPS诱导Mic激活的帕金森病免疫/炎症损伤大鼠模型，结合本实验中动物行为学改变、神经病理学以及神经生化检查证明该PD大鼠模型的病理过程符合PD病人的慢性进行性神经变性过程特点，可作为研究炎症反应对DA能系统影响的最佳模型。 2.以LPS刺激原代乳鼠中脑神经元和神经胶质细胞共培养体系成功建立了离体PD的免疫/炎症损伤细胞实验模型，对研究小胶质细胞介导的DA能神经元损伤机制及药物干预具有可行性和可信性。 3.研究表明LPS激活Mic后，Mic发生剧烈的形态学改变。在体实验表现为：从静止期分枝样，到部分激活的灌木丛样，直到完全激活的阿米巴样；离体实验表现为：细胞体积明显增大，为圆形或吞噬状，呈现巨噬细胞表型。 4.研究证实LPS诱导的Mic激活确实具有DA能神经元毒性作用，其毒性作用呈时间依赖性，并首次发现LPS诱导的Mic激活可能通过下调Nurr1表达这一途径加速DA能神经元变性坏死。 5.研究表明LPS诱导后，iNOS表达显著上调，首次发现其增加幅度较其他炎性细胞因子高，高水平的维持时间亦较其他细胞因子长，提示iNOS途径的激活在Mic活化后介导DA能神经元变性的分子机制中占据主要地位，有可能是始动神经元损伤的重要环节。研究发现LPS诱导Mic活化后，TNF-α、IL-1β等致炎性细胞因子释放的动力学特征是早期和短暂，其表达高峰明显早于DA能神经元损害的高峰期，提示Mic存在呼吸爆发系统可导致TNF-α、IL-1β等炎性因子在短时间呈爆发式释放。该结果表明Mic中iNOS、TNF-α、IL-1β等活性氧分子或前炎症细胞因子的表达具有瀑布效应，它们之间形成复杂的网络联系，可作为始发因素启动免疫应答，最终导致DA能神经元的损伤或死亡。 7.研究首次发现LPS诱导Mic活化后，抗凋亡蛋白BCL-2表达明显降低，并激活Caspase-3，TUNEL检测凋亡细胞数量明显增多，并与DA神经元丧失呈平行关系，提示细胞凋亡机制是Mic激活导致黑质DA能神经元损害的重要途径之一。 8.首次对美满霉素抑制LPS诱导的Mic激活和对DA能神经元损害的保护作用进行研究，发现1)美满霉素可通过抑制活化Mic在第一阶段的形态学改变和Mic增生而发挥其强烈的抑制Mic激活作用。2)Mino的干预可明显增加存活的DA能神经元数目，改善动物的协调运动能力，并通过升高DAT、Nurr1的表达水平，从而延缓Mic激活造成DA能神经元变性坏死的进程。3)Mino可通过上调抗凋亡蛋白BCL-2的表达，抑制Caspase-3的激活，从而减轻LPS诱导的黑质DA能神经元凋亡。4)Mino可在mRNA及蛋白质水平抑制激活Mic对iNOS、TNF-α和IL-1β的合成和分泌，阻断炎症级联放大机制，从而起到神经元保护作用。