研究背景心血管疾病及其并发症是临床常见病与多发病,尽管预防,诊断和治疗干预在预防心血管疾病的策略方面取得了重大进展,但冠状动脉疾病仍然是全球范围内致死和致残的重要原因。由于并非每个人都有发生未来心血管事件(Cardiovascular Event,CVE)的相同风险,因此心血管医学的一个重要挑战就是如何准确预测发生动脉粥样硬化相关的并发症的高危人群,如急性冠状动脉综合征(Acute Coronary Syndrome,ACS)。动脉粥样硬化是心血管疾病发病的病理基础,但其发病机制并不完全清楚。目前,研究动脉粥样硬化发生发展的机制从而寻找有效的干预靶点是心血管基础与临床研究的热点。国内外研究发现动脉粥样硬化形成的主流机制包括脂质浸润、慢性炎症、内皮损伤、氧化应激损伤及血流剪切力等。近年的研究发现,血管新生也是影响动脉粥样硬化发生发展的重要机制[1-4]。基于血管新生在动脉粥样硬化中的作用,对血管新生的研究也成为一个特殊的研究领域。探讨动脉粥样硬化斑块发生发展过程中血管新生的机制,寻找并干预影响血管新生的新靶点,从而预防甚至避免动脉粥样硬化性疾病的发生,是目前心血管领域的研究热点之一。内皮细胞在血管壁中发挥天然屏障功能,通过平衡释放作用于旁分泌和自分泌水平的细胞和分子成分,防止病原体入侵并维持血管完整性,在炎症、血管生成中起重要作用。血管内皮的完整性对于血液循环系统的平衡是非常重要的,血管功能障碍是动脉粥样硬化疾病的病理生理基础,内皮功能障碍可以被认为是动脉粥样硬化的起始阶段。内皮细胞代谢紊乱促成动脉粥样硬化病变的形成[5]。斑块新生血管由毛细血管网络组成,它来自外膜滋养血管并且延伸到动脉粥样硬化病变和其他类型的血管损伤的内膜层。这些斑块毛细血管的功能被认为是斑块生长和病变不稳定性的重要调节剂。一些分子通路在动脉粥样硬化和癌症的发病机制和进展中具有的类似作用,与这两种疾病有关的共同机制包括氧化应激和由此引起的细胞损伤。血管新生在动脉粥样硬化和其他心血管疾病中的作用目前还是一个尚未完全阐明的问题。目前已有诸多研究表明新血管形成有助于动脉粥样硬化病变的生长,并且是导致斑块破裂、不稳定的关键因素,预防动脉粥样硬化斑块内的血管新生有可能起到稳定易损斑块的重要作用。ErbB2(Erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2,成红细胞生长白血病病毒致癌基因同源物2),在人类中也称为Her2,是表皮生长因子受体(EGFR)的重要成员之一。Erbin(ErbB2相互作用蛋白),其氨基末端含有16个富含亮氨酸的重复序列(LRR),而其羧基末端含有PDZ(PSD95/Discslarge/ZO-1)结构域终点,属于新的LAP蛋白家族成员,借PDZ结构域与ErbB2紧密结合,最早报道与ErbB2特异性相互作用[6]。据报道,Erbin在大多数人体组织中表达,特别是在脑,心脏,肾脏,肌肉和胃中表达丰富。Erbin是ErbB2/Her2的相互作用蛋白,Erbin可直接并特异性地与ErbB2/Her2相互作用,并将ErbB2/Her2定位于上皮细胞基底外侧膜。ErbB2已被证明在血管发育中起重要作用,因为ErbB2可增加血管内皮生长因子(VEGF)的合成,导致血管生成增加[7]。然而,ErbB2发挥作用的机制尚不够明确。ErbB2/Her2在细胞增殖和分化,尤其是血管生成过程中发挥极其重要的作用。ErbB2不仅能够促进VEGF的表达,导致内皮侵袭能力增加,更进一步促进血管新生;ErbB2表达于冠状血管内皮,并在冠状血管的发育过程中发挥了无可替代的作用。目前尚存在以下问题亟待探讨和解决:①目前尚不清楚Erbin是否在 管中表达;②如果Erbin在血管中表达,其具体细胞定位如何确定;③Erbin是否影响内皮细胞的生物学功能;④Erbin影响细胞生物学功能的具体信号转导通路。基于以往的研究,我们设计了目前的实验来验证Erbin和血管及内皮细胞的关系,以及Erbin对内皮细胞功能的影响,并进一步探讨其影响细胞功能的分子生物学机制或信号传递途径。研究目的以人脐静脉内皮细胞作为细胞模型,通过转染Erbin干扰慢病毒,抑制内源性Erbin的表达,观察人脐静脉内皮细胞的增殖、凋亡、迁移及成管等现象的变化,进而通过体外实验明确Erbin对人脐静脉内皮细胞作用的相关信号通路,以进一步行体内实验探究Erbin影响血管新生的机制,寻找影响血管新生与动脉粥样硬化的新靶点。研究方法(课题分为两部分):一、以人脐静脉内皮细胞为细胞模型,研究Erbin对内皮细胞增殖、凋亡、迁移和成管等生物学行为的影响1.组织免疫荧光技术检测Erbin在血管中的表达与定位取人脐带进行组织学固定,石蜡包埋后切片,进行组织免疫荧光,观测Erbin在血管中的表达与定位。2.Erbin干扰慢病毒的构建与筛选用编码Erbin siRNA或乱序序列构建3种不同的慢病毒并感染人脐静脉内皮细胞后,应用Western印迹技术确定抑制内源性Erbin表达的最有效的干扰序列,用于后续实验。3.研究Erbin对人静脉内皮细胞增殖、凋亡的影响3.1通过CCK-8法检测Erbin对内皮细胞增殖活力的影响人脐静脉内皮细胞转染Erbin干扰慢病毒后,应用CCK-8增殖试剂盒在不同时间点检测内皮细胞的增殖活力。3.2通过流式细胞分析技术检测Erbin对细胞凋亡的影响人脐静脉内皮细胞转染Erbin干扰慢病毒后,使用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂双染内皮细胞,然后应用流式细胞分析技术检测内皮细胞凋亡的变化情况。4.研究Erbin对人静脉内皮细胞迁移和成管的影响4.1通过细胞划痕实验与Transwell迁移实验检测Erbin对细胞迁移能力的影响人脐静脉内皮细胞转染Erbin干扰慢病毒后,应用细胞划痕实验与Transwell迁移实验检测内皮细胞迁移的变化。4.2通过内皮细胞成管实验检测Erbin对人脐静脉内皮细胞的成管能力的影响人脐静脉内皮细胞转染Erbin干扰慢病毒后,应用细胞成管实验检测内皮细胞的成管能力。5.统计学分析选取PASW Statistics(SPSS Statistic)v18.0.0预测分析软件,用于分析评估研究中的数据。采用单向方差分析(ANOVA)比较不同试验组之间的正常分布的数据,Mann-Whitney U检验分析用于非参数变量的分析。研究数据P<0.05以上,差异被认为有统计学意义。二、Erbin影响内皮细胞迁移和成管的机制研究1.通过Western blot检测Erbin对人脐静脉内皮细胞ERK信号通路的影响在人脐静脉内皮细胞转染Erbin干扰慢病毒后,收集经相应处理的细胞,提取细胞蛋白,应用Western blot法,以GAPDH作为内参检测Erbin的表达。以相应非磷酸化状态为内参,检测t-ERK、p-ERK的表达。2.研究Erbin对人脐静脉内皮细胞Smad信号转导通路的影响2.1 Western blot法检测Erbin对人脐静脉内皮细胞Smad信号通路的影响在人脐静脉内皮细胞转染Erbin干扰慢病毒后,收集经相应处理的细胞,提取细胞蛋白,应用Western blot法,以GAPDH作为内参检测Erbin的表达。以相应非磷酸化状态为内参,检测t-Smad2、p-Smad2、t-Smad3、p-Smad3、t-Smad1、p-Smad1/5、t-Smad5的表达。2.2细胞免疫荧光染色检测Smad1/5的磷酸化与核转位人脐静脉内皮细胞转染Erbin干扰慢病毒后,我们应用细胞免疫荧光技术检测t-Smad1、p-Smad1/5、t-Smad5的在核内核外表达水平的变化。2.3 Smad siRNA阻断Smad1/5通路后人脐静脉内皮细胞迁移和成管现象的变化应用Smad siRNA、Smad5 siRNA对转染Erbin干扰慢病毒的人脐静脉内皮细胞进行预处理,抑制相关Smad1/5信号通路,观察Smad1/5信号通路的抑制对Erbin敲低后人脐静脉内皮细胞迁移和管状结构形成的影响。3.统计学分析选取PASW Statistics(SPSS Statistic)v18.0.0预测分析软件,用于分析评估研究中的数据。采用单向方差分析(ANOVA)比较不同试验组之间的正常分布的数据,而非参数变量使用Mann-Whitney U检验进行分析。数据分析结果以P<0.05为有统计学意义。研究结果一.Erbin在血管内皮细胞中呈阳性表达,且能促进人脐静脉内皮细胞的迁移和成管能力。1.免疫荧光技术显示Erbin主要在人脐静脉内皮细胞中表达在获得人体新鲜脐静脉组织后,应用免疫荧光技术方法,发现Erbin在人脐静脉血管中表达,还观察到Erbin和脐静脉内皮细胞在血管中共定位。2.成功构建Erbin干扰慢病毒序列用编码Erbin siRNA或乱序序列的3种不同的慢病毒感染人脐静脉内皮细胞后,应用Western印迹技术确定抑制内源性Erbin表达的最有效的干扰序列。3.Erbin对人脐静脉内皮细胞增殖与凋亡无影响在使用慢病毒转染人脐静脉内皮细胞后的不同时间点应用CCK-8增殖试剂盒检测细胞活力,LV对照组和LV-Erbin实验组之间没有差异,证实Erbin对人脐静脉内皮细胞增殖无明显影响。使用Erbin干扰慢病毒转染人脐静脉内皮细胞48小时后,再用H2O2(3000μM)刺激24小时,诱导细胞凋亡,应用AnexcinV/PI双染细胞后,流式细胞分析技术检测内皮细胞凋亡,LV对照组和LV-Erbin实验组之间没有显著差异,证实Erbin对人脐静脉内皮细胞的凋亡无明显影响。4.Erbin促进人脐静脉内皮细胞的迁移和成管能力使用Erbin干扰慢病毒转染人脐静脉内皮细胞抑制内源性Erbin的生成后,应用细胞划痕试验及Transwell迁移实验检测,发现人脐静脉内皮细胞的迁移能力及成管能力明显下降。二、Erbin促进人脐静脉内皮细胞迁移和成管的机制1.Erbin对ERK蛋白磷酸化水平无明显影响人脐静脉内皮细胞转染Erbin干扰慢病毒后,收集经相应处理的细胞,提取细胞蛋白,应用Western blot法,以GAPDH作为内参检测Erbin的表达。以相应非磷酸化状态为内参,检测t-ERK、p-ERK的表达,LV对照组和LV-Erbin组之间没有显著差异。2.Erbin主要通过抑制Smad1/5磷酸化影响人脐静脉内皮细胞的迁移和成管2.1 Erbin对Smad2/3蛋白磷酸化水平无明显影响使用Erbin干扰慢病毒敲低人脐静脉内皮细胞内源性Erbin后,应用Western blot法,以相应非磷酸化状态为内参,检测t-Smad2、p-Smad2、t-Smad3、p-Smad3的蛋白表达水平均未发生明显变化。2.2 Erbin抑制Smad1/5磷酸化使用Erbin干扰慢病毒敲低人脐静脉内皮细胞内源性Erbin后,通过Western blot法,以相应非磷酸化状态为内参,检测t-Smad1、p-Smad1/5、t-Smad5,发现Erbin的敲低不仅促进Smad1/5磷酸化,而且还促进磷酸化Smad1/5的核转位。2.3细胞免疫荧光染色发现Erbin抑制人脐静脉内皮细胞Smad1/5磷酸化和核转位人脐静脉内皮细胞在转染Erbin干扰慢病毒抑制内源性Erbin后,不仅促进Smad1/5磷酸化,而且还促进磷酸化Smad1/5的核转位。2.4 Smad1/5通路的阻断消除了Erbin敲低抑制人脐静脉内皮细胞的迁移和成管的能力应用Smad1 siRNA和Smad5 siRNA和同时使用Smad1/5 siRNAs对细胞进行预处理2小时,结果表明同时应用Smad1和Smad5 siRNAs对Smad1/5信号通路的抑制作用更有效;并且对Smad1/5通路的阻断显著消除了 Erbin敲低对人脐静脉内皮细胞迁移和管状结构形成的抑制作用,强烈提示Erbin主要通过Smad1/5途径促进内皮细胞迁移和管状结构形成。结论1.Erbin在人脐静脉内皮细胞中表达。2.Erbin对人脐静脉内皮细胞的增殖与凋亡无影响。3.Erbin促进人脐静脉内皮细胞的迁移和成管能力。4.Erbin对ERK和Smad2/3蛋白的磷酸化水平均无影响,可能通过抑制Smad1/5磷酸化和磷酸化Smad1/5的核转位,而促进人脐静脉内皮细胞迁移和成管。