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隐孢子虫(Cryptosporidium)是一种重要的人畜共患食源性寄生虫,属细胞内专性寄生的顶复门原虫,主要侵害人和大多数脊椎动物的胃肠道和呼吸道上皮细胞,引起不同程度的疾病症状。隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)是由一种或几种隐孢子感染而引起的疾病,目前为止,已有100多个国家报道过此病。隐孢子虫是机会致病病原,对于老人、小孩、免疫缺陷患者(尤其是AIDS),此病将导致严重的腹泻或营养不良,有时甚至危及生命。
隐孢子虫能感染30多种禽类,引起禽类的消化道和呼吸道疾病,导致生长速度减慢、产蛋性能下降等结果;严重感染时(尤其对于产蛋鸡),呈现高死亡率,造成巨大的经济损失。禽类隐孢子虫有效种仅有3个,分别是贝氏隐孢子虫(C.baileyi)、火鸡隐孢子虫(C.meleagridis)、鸡隐孢子虫(C.galli);另外据研究报道的有11种基因型,分别是禽基因Ⅰ-Ⅴ型(Avian genotypeⅠ-Ⅴ)、鹅基因Ⅰ-Ⅳ型(Goose genotypeⅠ-Ⅳ)、鸭基因型(Duck genotype)、丘鹬基因型(Eurasianwoodcock genotype),它们在基因水平和形态上均有较大差异。禽类流动性大、不易控制,尤其有些鸟类随季节变化南北迁移,若作为隐孢子虫传染源将存在巨大的公共卫生学安全隐患。
为系统掌握浙江地区鸡源隐孢子虫流行情况,2010年11月至2012年1月,对浙江省7个不同地区采集样品385份,分别用改良抗酸性染色和饱和蔗糖漂浮法检测样品,进行禽类隐孢子虫感染情况的调查。检测结果显示:平均感染率为9.87%(38/385),杭州、湖州、嘉兴、金华、宁波、绍兴、衢州各地区感染率分别为16.7%、16.9%、7.7%、12.1%、5.26%、2.33%、4.00%。对阳性样品中卵囊形态大小进行测量,发现绝大部分阳性样品中卵囊大小为5.42μm-6.72μm×4.53μm-5.62μm,平均5.96μm×4.73μm,平均卵囊指数为1.26,根据卵囊形态及DIC形态观察初步可确定绝大部分为C.baileyi。
为鉴定浙江省鸡源隐孢子虫的种类/基因型,应用Xiao等建立的18S rRNA基因巢氏PCR-RFLP方法可快速得到初步结果。基于18S rRNA基因,对25个鸡源隐孢子虫分离株进行巢氏PCR扩增,目的片段约830bp;用限制性内切酶SspI和VspI对PCR产物进行酶切,酶切产物进行凝胶电泳;结果显示:25个分离株中有20个为C.baileyi,2个为C.meleagridis,另外3个样品酶切结果异常,不能确定具体的种类/基因型。
通过基于18S rRNA基因种系发育关系鉴定浙江省鸡源隐孢子虫分离株的种类/基因型,利用巢氏PCR对12个需进一步分析的隐孢子虫分离株的18S rRNA进行扩增,并对扩增序列进行测序。获得目的序列后,从GenBank上下载相关序列,并用DNAStar、MEGA4.0进行序列同源性及种系发育关系分析,确定分离株为C.baileyi、C.meleagridis、Avian genotypeⅡ,且来自不同地区的分离株序列存在一定差异。另外,C.baileyi为浙江省鸡源隐孢子虫的优势虫种,分布范围广泛,感染率高。
本试验提供了浙江部分地区鸡源隐孢子虫的感染情况及分子流行病学数据,为控制人畜共患隐孢子虫病的爆发提供了一定的理论依据,具有重要的公共卫生学意义。