【摘 要】
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目的:以乙醇浓度、提取时间、料液比为考察因素,以大鼠BMSCs增殖率为指标,采用正交设计法、层次分析法优选二仙汤最佳提取工艺,将提取出的二仙汤有效组分作用于大鼠BMSCs,观察细胞Wnt/β-catenin信号通路中的Wnt7b、Runx2、Axin2等相关因子蛋白表达的变化,探究二仙汤防治OP的相关作用机制,为临床治疗OP提供新的实验方向。材料与方法:二仙汤原方48g即淫羊藿:仙茅:巴戟天:当归
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目的:以乙醇浓度、提取时间、料液比为考察因素,以大鼠BMSCs增殖率为指标,采用正交设计法、层次分析法优选二仙汤最佳提取工艺,将提取出的二仙汤有效组分作用于大鼠BMSCs,观察细胞Wnt/β-catenin信号通路中的Wnt7b、Runx2、Axin2等相关因子蛋白表达的变化,探究二仙汤防治OP的相关作用机制,为临床治疗OP提供新的实验方向。材料与方法:二仙汤原方48g即淫羊藿:仙茅:巴戟天:当归:知母:黄柏=9:9:9:9:6:6,取原方?量进行提取。以乙醇浓度（35%、55%、75%）、提取时间（1.5h、2h、2.5h）、料液比（1:10、1:15、1:20）为考察因素,每个因素依次设计3个水平,按照L9（3~4）设计正交试验。将等到的9份样品浓缩定容,以芦丁为对照品使用紫外可见分光光度计,测得9份样品总黄酮含量;以淫羊藿苷为对照品使用高效液相色谱仪,测得9份样品淫羊藿苷含量。将9份样品过滤配置浓度为0.001g（生药）·m L-1的含药培养液,作用于Wistar大鼠BMSCs复苏、繁殖、传代到第四代的对数期细胞,MTT法测得细胞增殖率。运用正交设计法、层次分析法优选出二仙汤最佳提取工艺。将最佳提取工艺优选出的二仙汤有效组分作用于大鼠BMSCs,实验将大鼠BMSCs分为以下9组:正常组、阳性转化液组、二仙汤有效组分低浓度组、二仙汤有效组分中浓度组、二仙汤有效组分高浓度组、二仙汤有效组分中浓度组+DKK-1、二仙汤有效组分高浓度组+DKK-1、阳性转化液组+DKK-1。指标检测:MTT法检测细胞增殖,用茜素红染色法观察15天矿化结节的形成,ELISA法检测ALP活性和Wnt7b、Axin2、Runx2蛋白的表达。结果:1.二仙汤提取工艺结果显示:以BMSCs细胞增殖率为指标,影响二仙汤提取工艺的因素,其中乙醇浓度（A）和料液比（C）对细胞增殖率影响较大（P＜0.05）,为主要因素;提取时间（B）影响较小,无统计学意义。2.MTT增殖结果显示:与正常组比较,细胞培养24h、48h和72h,二仙汤有效组分低浓度、二仙汤有效组分中浓度、二仙汤有效组分高浓度的细胞增殖能力降低（P＜0.01）;与二仙汤有效组分低浓度比较,细胞培养48h、72h,二仙汤有效组分中浓度细胞增殖能力降低（P＜0.01）;与二仙汤有效组分中浓度比较,细胞培养24h、48h和72h,二仙汤有效组分中浓度+DKK-1细胞增殖能力降低（P＜0.01）;与二仙汤有效组分高浓度比较,细胞培养24h、48h和72h,二仙汤有效组分高浓度+DKK-1细胞增殖能力降低（P＜0.01）;与阳性转化液比较,细胞培养24h、48h和72h,阳性转化液+DKK-1细胞增殖能力降低（P＜0.01）。3.15天茜素红染色结果显示:阳性转化液的矿化结节数目最多,体积较其他组大;二仙汤有效组分低浓度组、二仙汤有效组分中浓度组、二仙汤有效组分高浓度组的矿化结节均较正常组多,且体积明显增大,其中二仙汤有效组分低浓度组的矿化结节最多;阳性转化液组、二仙汤有效组分中浓度组和二仙汤有效组分高浓度组加入DKK-1之后,矿化结节数量明显减少,体积偏小,矿化水平降低。4.ELISA结果显示:与正常组相比较,成骨细胞在阳性转化液组、二仙汤有效组分低浓度组的ALP活性及Wnt7b、Axin2和Runx2蛋白表达上调（P＜0.05）;与阳性转化液组相比,二仙汤有效组分低浓度组、二仙汤有效组分中浓度组、二仙汤有效组分高浓度组、二仙汤有效组分中浓度组+DKK-1、二仙汤有效组分高浓度组+DKK-1、阳性转化液组+DKK-1的ALP活性及Wnt7b、Axin2和Runx2蛋白表达下调（P＜0.01）;二仙汤有效组分中浓度组和二仙汤有效组分高浓度组在添加DKK-1后,ALP活性及Wnt7b、Axin2和Runx2的蛋白表达均明显下调（P＜0.05）。结论:1.以乙醇浓度、提取时间、料液比为考察因素,以大鼠BMSCs增殖率为指标,采用正交设计法、层次分析法优选二仙汤最佳提取工艺为20倍量、55%乙醇、回流提取1.5 h。2.二仙汤有效组分能够增强矿化结节的形成,可以促进BMSCs成骨分化,调节骨代谢,维持骨量的稳定。3.二仙汤有效组分可以提高大鼠BMSCs中ALP活性和Wnt7b、Runx2、Axin2蛋白表达量,证明二仙汤有效组分可能是通过激活Wnt/β-catenin信号通路中的Wnt7b、Runx2、Axin2来促进成骨分化,起到防治OP的作用。
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