Ac3AESA抑制HMGB1/TLR4信号通路减轻小鼠肝脏缺血再灌注损伤

来源 :昆明医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:D159357
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[目 的]肝脏移植(liver transplantation,LT)是治疗肝脏恶性肿瘤及终末期肝病的有效手段,缺血/再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)仍是目前肝移植术后肝功能不良或无功能,甚至移植失败的最重要原因之一。随着新型免疫抑制剂的应用,在肝移植过程中IRI已经超越急性排斥反应成为导致移植肝脏损伤、术后移植物功能延迟恢复以及原发性无功能进而导致急性肝功能衰竭的主要原因。有研究认为在肝脏缺血再灌注损伤(hepatic ischemiareperfusioninjury,HIRI)期间,高迁移率族蛋白 B1(High Mobility Group Box 1,HMGB1)通过 Toll 样受体 4(Toll-like receptor 4,TLR4)可促进肝细胞死亡和促炎细胞因子分泌,而水杨酸盐能抑制HMGB1-TLR4的相互作用,但其对肝细胞损害是否具有保护作用尚无文献报道。因此,本研究通过体内及体外实验探讨水杨酸盐可能通过抑制HMGB1/TLR4轴激活来改善HIRI诱导的肝损伤及其机制。[方法]1.以氢化可的松、他克莫司处理供体后构建免疫抑制野生型(Wild Type,WT)小鼠 IRI 模型,予以 4-HBA(4-hydroxybenzoicacid,4-HBA)、SA(salicylic acid,SA)、ac3AESA(aceyyl-3-aminoethyl salicylic acid,ac3AESA)、生理盐水,分为4-HBA、SA、ac3AESA、对照组四组;以生理盐水做对照处理供体后构建非免疫抑制小鼠IRI模型,同样予以4-HBA、SA、ac3AESA、生理盐水分为四组;检测三种水杨酸盐对HIRI的有效剂量;全自动生化分析仪检测血清转氨酶水平;肝脏组织标本通过苏木精-伊红染色(hemotoxylin and eosin staining,HE)观察肝脏病理学改变;原位末端转移酶标记技术(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay,TUNEL)明确肝细胞凋亡情况。2.酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELIS A)检测小鼠血清中HMGB1水平,蛋白免疫印记法(westemblotting assay,WB)检测小鼠肝细胞中HMGB1、TLR4表达水平;建立WT小鼠IRI模型,分为SA组、ac3AESA组、IR组、假手术组,1h、6h分别处死小鼠采集标本,WB检测缺血肝组织 IκBα、ERK、JNK、p38 MAPK、caspase-3、caspase-1 及其磷酸化蛋白表达水平。建立TLR4基因敲除(TLR4knockout,TLR4KO)小鼠IRI模型,分为SA组、ac3AESA组、IR组、假手术组;全自动生化仪检测肝脏酶学指标;ELISA检测小鼠血清中HMGB1水平;WB检测小鼠肝细胞中HMGB1、TLR4、IκBα、ERK、JNK、p38 MAPK、caspase-3、caspase-1 及其磷酸化蛋白表达水平。3.分离培养各组IRI小鼠枯否氏细胞(Kupffer Cells,KCs),定量即时聚合酶链锁反应(Real-time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)检测 KCs 中 TNF-α、IL-6、IL-1p、CXCL1、CXCL2 和 CXCL8 转录水平。分离培养 WT 及 TLR4 KO小鼠原代KCs,予以重组HMGB1(1或5μg/mL)以及SA(10或30 μM)或ac3AESA(0.1或0.2 μM),48h后ELISA检测培养液中TNF-α表达水平。4.构建WT及TLR4 KO小鼠原位肝移植模型,予以不同方案ac3AESA处理;每组取10只小鼠观察各组术后生存时间及生存率;全自动生化仪检测肝脏酶学指标;ELISA检测小鼠血清中HMGB1水平,WB检测小鼠肝细胞中HMGB1、IκBα、ERK、JNK、p38MAPK、caspase-3、caspase-1 及其磷酸化蛋白表达水平。5.构建三种冷缺血时间(12h,18h,24h)WT小鼠原位肝移植模型,予以ac3AESA方案处理及对照;每组取10只小鼠观察各组术后生存时间及生存率;全自动生化仪检测肝脏酶学指标;ELISA检测小鼠血清中HMGB1水平;HE及TUNEL明确肝脏病理学改变及肝细胞凋亡情况。[结 果]1.IRI小鼠术后存活良好,表明建模成功。免疫抑制模型中,ac3AESA组及SA组与对照组相比,血清酶学结果ALT、ATS明显降低,4-HBA组未见明显改变;取再灌注6 h肝脏标本行病理学检查可见大量炎症细胞浸润,正常肝脏结构受损,TUNEL检查提示肝细胞凋亡严重,4-HBA组无明显差异,而ac3AESA组及SA组肝脏的组织损伤明显缓解;在非免疫组中显示同样的结果。2.小鼠IRI免疫抑制模型中,6h后,ac3AESA组血清和肝组织中HMGB1与TLR4表达水平显著低于其余各组,SA组与对照组比较表达水平降低,4-HBA组较对照组无明显变化;非免疫模型中结果与免疫模型相同。非免疫抑制模型中,1h后,ac3AESA组IκBα、ERK、JNK、p38 MAPK及其磷酸化水平均受抑制,caspase-3、caspase-1 表达显著降低;6h 后 ac3AESA 组 IκBα、ERK、p38MAPK及其磷酸化水平仍明显低于各组,caspase-3、caspase-1表达减少;SA组在1h后除caspase-1表达较对照组降低外,其余各蛋白表达与对照组无明显变化,6h后IκBα、ERK、p38 MAPK及其磷酸化水平开始降低,caspase-3、caspase-1表达减少。在TLR4KO小鼠IRI模型中,6h后各组检测结果未见明显改变。3.鉴定提取的小鼠KCs提示其纯度活性良好,满足实验需求。WT小鼠模型中,ac3AESA 组 KCs 中 TNF-α、IL-6、IL-1β、CXCL1、CXCL2 和 CXCL8转录水平较其余各组明显降低,SA组较IR组转录水平下调,TLR4KO小鼠IRI模型中,各组KCs中促炎因子及趋化因子转录水平无改变。WT小鼠原代KCs中,予以重组HMGB1(1或5 μg/mL)后,再给予SA(30μM)或ac3AESA(0.1 or 0.2μM)后TNF-α表达水平显著降低,TLR4 KO小鼠KCs未见此改变。4.成功构建小鼠原位肝移植模型。WT小鼠模型中,长效ac3AESA方案可显著提高小鼠术后生存率,减轻血清酶学改变,降低HMGB1,抑制HMGB1/TLR4信号激活;短效及预处理方案无明显效果。TLR4 KO小鼠原位肝移植模型中,三种方案未见明显改变。5.在不同的冷缺血时间中,ac3AESA组与对照组相比,生存率及生存时间、肝脏酶学改变、HMGB1表达水平、肝脏病理学改变及肝细胞凋亡情况都有明显改善。[结论]1.ac3AESA与SA对小鼠肝IRI具有保护作用,ac3AESA作用效果较SA更快更强,且能有效减轻小鼠肝移植IRI损伤2.ac3AESA对IRI的保护机制可能与抑制HMGB1/TLR通路活性,降低KCs炎性因子转录分泌,减少肝细胞凋亡等有关。
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