弓形虫,为顶复动物门寄生原虫,可感染人类和几乎其他所有的温血动物,常引起孕妇妊娠阶段流产,胎儿畸形、先天性缺陷或死胎等严重后果,免疫能力低下人群感染严重疾病。近几年研究表明,弓形虫还会影响宿主的一些行为举止,甚至与多种精神疾病有关。据国外报道,人感染弓形虫的平均感染率为25%~50%。而我国的人群感染率在0.1%~47.3%,猪感染率为4.78%~85.7%,牛的感染率为0.2%~43.4%。可见弓形虫病已经严重影响了人类的健康生活和畜牧业的发展。蛋白激酶(Protein Kinase,PK)在弓形虫增殖、分化和感染过程中起着至关重要的作用。以往研究表明,钙依赖蛋白激酶Ⅰ(CDPK1)在弓形虫胞吐中起着重要的调节作用;丝裂原活化蛋白激酶Ⅰ(MAPK1)通过诱导一氧化氮复合物(iNOS)合成抑制干扰素(IFN)合成,调节弓形虫的增殖;棒状体蛋白激酶是一种弓形虫特有的蛋白激酶,参与调控弓形虫对宿主免疫反应的影响。酪蛋白激酶(CK)是真核生物的一种保守的丝/苏氨酸蛋白激酶,由Bnrnet在1954年在大鼠的肝脏中发现的,其功能是催化肽链中邻近酸性氨基酸残基的丝氨酸/苏氨酸磷酸化。该蛋白激酶由Ⅰ型酪蛋白激酶(Casein Kinase 1,CK1)和Ⅱ型酪蛋白激酶(Casein Kinase 2,CK2)两大家族蛋白组成。CK1参与调节多种重要的细胞过程,包括wnt信号通路、膜运输、细胞骨架的维护等。最近研究发现多种原核生物有CK1基因表达,如弓形虫、疟原虫、利氏曼原虫、锥虫等。此外,CK1抑制剂还可以抑制鞭毛虫和锥虫在血液中的增殖。CK1在机体多种生理活动中发挥着举足轻重的作用,如细胞分裂与凋亡、DNA修复、P53调控、周期性节律等。弓形虫基因组可以编码CK1α和CK1β两种CK1亚型,其中只有CK1α具有酶活性。CK1α是一种非第二信使依赖的激酶,以ATP作为单一磷酸供体,分布于细胞的细胞膜、细胞质以及细胞核中。在哺乳动物中,CK1α参与多种细胞生理活动,如细胞周期、染色体分离、膜转运、细胞分化和细胞凋亡等。此外,CK1α参与Wnt/β-Cat、Hedgehog(Hh)及NF-κB等信号通路。弓形虫作为一种重要的模式生物和人兽共患病原,CK1α基因在其感染宿主过程中的作用还不清楚。研究目的:利用实验室已有的CK1α克隆缺失株(△ck1α)感染BALB/c小鼠,通过与野生株GT1对比,确定CK1α对弓形虫感染宿主毒力的影响。利用荧光定量PCR、elisa、转录组测序和westernblot等方法,推论出ck1α调节弓形虫毒力的具体机制。为预防弓形虫感染,研制疫苗和治疗药物提供一定的依据。研究内容:1、通过小鼠攻虫试验,确定ck1α缺失对弓形虫毒力的影响;2、研究ck1α调节弓形虫毒力的具体机制。研究方法:1、确定ck1α对弓形虫毒力的影响90只6~8周龄balb/c雌性小鼠,采用随机分组的方法分为9组,每组十只小鼠,每只小鼠腹腔接种200μl弓形虫速殖子稀释液。第一组:每只小鼠接种102个gt1速殖子;第二组:每只小鼠接种103个gt1速殖子;第三组:每只小鼠接种104个gt1速殖子;第四组:每只小鼠接种102个△ck1α速殖子;第五组:每只小鼠接种103个△ck1α速殖子;第六组:每只小鼠接种104个△ck1α速殖子;第七组:每只小鼠接种102个ck1α回补株速殖子;第八组:每只小鼠接种103个ck1α回补株速殖子;第九组:每只小鼠接种104个ck1α回补株速殖子;根据小鼠死亡时间绘制生存曲线,分析ck1α缺失对于宿主生存时间的影响。在感染第3天和第7天处死感染小鼠,观察小鼠肝组织损伤状况,elisa检测天冬门氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase,ast)和谷丙转氨酶(alaninetransaminase,alt)含量,定量pcr(rt-pcr)检测肝脏组织和脾脏组织荷虫量,流式细胞术检测血清中il-12、ifn-γ等细胞因子含量,分析ck1α缺失对弓形虫毒力的影响。2、确定ck1α调节弓形虫毒力的机制取感染3天和7天小鼠的肝脏组织和脾脏组织,westernblot检测肝脏组织和脾脏组织中mapk信号通路、nf-κb信号通路和stat信号通路活化情况,荧光定量pcr(rt-pcr)检测肝脏组织和脾脏组织中il-12、ifn-γ等细胞因子含量,转录组测序检测棒状体蛋白转录水平变化。确定ck1α调节弓形虫毒力的具体机制。研究结果:1、ck1α缺失后,小鼠生存时间减短。第三组小鼠在腹腔注射5天后出现明显的体外特征,在注射7-9天内死亡,平均存活时间(mst)为7.7天。第一组和第二组小鼠在注射后10-13天死亡,mst分别为11.4天和10.4天。第六组小鼠在腹腔注射后4天出现明显症状,在注射6-8天死亡,mst为6.8天。第四组和第五组在注射后8-12天死亡,mst分别为10.5天和8.4天。注射回补株组mst与等量注射gt1速殖子组mst无明显差异(p>0.05)。2、CK1α缺失后,弓形虫毒力增加。△ck1α感染小鼠,肝组织较GT1野生株出现明显的病理性损伤;天门冬氨酸氨基转移酶(AST)含量相较于GT1感染小鼠均提高了4~6倍,而谷丙转氨酶(ALT)含量提高了2~4倍;肝脾组织荷虫量均明显高于GT1感染小鼠;△ck1α感染小鼠血清中IL-12和IFN-γ分泌量低于GT1感染小鼠。3、△ck1α通过ROP16活化STAT3抑制IL-12分泌,增加弓形虫毒力。△ck1α感染小鼠,肝脾组织中MAPK信号通路蛋白和NF-κB信号通路蛋白基本无明显差异,只有肝组织内MAPK p38磷酸化程度增加,这可能是导致肝组织严重损伤的原因。肝脾组织中STAT1/4蛋白磷酸化程度均低于GT1感染小鼠,STAT3/6明显高于GT1,转录组测序检测发现ROP16蛋白分泌量△ck1α感染小鼠明显高于GT1。研究结论:1、△ck1α感染小鼠生存时间明显减短,CK1α缺失后,弓形虫毒力显著增强;2、△ck1α通过分泌过量的ROP16蛋白活化STAT3来抑制IL-12的分泌,增强了弓形虫的毒力。