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目的:由于肥胖和2型糖尿病(T2DM)的流行,非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的发病率逐年增高,目前已成为慢性肝脏疾病的主要病因。有效治疗NAFLD不但可以减少终末期肝病发病率,而且可以降低T2DM大血管和微血管并发症及心血管疾病死亡率,因此,对于NAFLD的防治刻不容缓。近年来,越来越多的研究表明胰高血糖素样肽-1受体激动剂(GLP-1Ra)利拉鲁肽可以安全有效的改善NAFLD,然而其潜在机制尚未阐明。本研究以高脂饮食(HFD)诱导的NAFLD小鼠和棕榈酸(PA)诱导脂肪变的人肝细胞系(HL-7702)为研究对象,旨在探讨高脂对肝脏脂质代谢的关键酶—脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)的影响,并探究其在NAFLD发生和发展中的重要作用;通过RNA芯片和生物数据库筛选出影响ATGL表达的miR-124a,进一步应用细胞转染技术验证miR-124a是否通过抑制ATGL/Sirt1信号通路进而影响肝细胞内脂质代谢和炎症反应;并且应用利拉鲁肽干预NAFLD小鼠和PA诱导的脂肪变的肝细胞,进一步探讨利拉鲁肽是否通过miR-124a/ATGL/Sirt1信号通路改善NAFLD。方法:1.以HFD诱导的NAFLD小鼠为研究对象,随机分为两组,分别为普通饮食组(chow)和HFD组。HFD干预12周后,HE染色和油红O染色检测肝脏组织中甘油三脂(TG)的沉积,评估HFD对小鼠肝脏脂质沉积的作用;免疫组织化学染色和q RT-PCR检测肝脏组织内炎症因子的表达,观察HFD对肝脏炎性浸润的影响;q RT-PCR、western blot和免疫荧光染色观察HFD对肝脏脂质代谢关键酶ATGL基因和蛋白表达的影响;应用基因芯片技术检测两组小鼠肝脏组织差异性miRNAs的表达,筛查HFD对肝脏组织中miRNAs表达的影响。2.以PA诱导的脂肪变HL-7702细胞为研究对象,分为正常对照组(NC)和PA干预组(PA),油红O染色和OD520检测细胞内脂质含量,western blot检测脂肪变肝细胞中ATGL的蛋白表达;生物信息学数据库检索影响ATGL表达的miRNAs;q RT-PCR检测脂肪变肝细胞中调控ATGL m RNA表达的miRNAs;双荧光素酶报告实验进一步验证miRNA与ATGL的作用关系;细胞转染miRNA抑制剂和类似物进行功能获得性和功能缺失性研究,以探究miRNA在NAFLD中的作用及相关机制。3.以HFD诱导的NAFLD小鼠为研究对象,HFD干预12周后,随机分为3组,分别为chow组、HFD组和利拉鲁肽干预组(HFD+Lira组)。称量三组小鼠肝脏重量,检测一般代谢指标、肝脏内脂质和炎症指标,评估利拉鲁肽对脂肪肝内脂质沉积和炎症反应的改善作用;免疫荧光染色和western blot检测利拉鲁肽对肝脏组织内ATGL/Sirt1信号蛋白以及炎症因子表达的影响,q RT-PCR检测利拉鲁肽对肝脏miR-124a的作用,以评估利拉鲁肽是否通过调控miR-124a的表达,进而调控下游信号蛋白ATGL/Sirt1的表达。4.以PA诱导的脂肪变HL-7702细胞为研究对象,细胞免疫荧光染色和western blot检测利拉鲁肽对脂肪变肝细胞内ATGL/Sirt1信号蛋白以及炎症因子表达的影响;脂肪变HL-7702细胞转染miRNA类似物的同时,给予利拉鲁肽干预,western blot检测信号蛋白ATGL、Sirt1以及炎性指标的表达,深入探讨miR-124a是否介导利拉鲁肽对ATGL/Sirt1信号通路的调控作用。结果:一、HFD对小鼠代谢指标和肝脏脂质代谢及炎性浸润的影响1.与chow组小鼠相比,HFD组小鼠体重、血糖、血脂等指标明显升高,肝脏内TG沉积明显增多;HFD组巨噬细胞标志物CD68表达明显增加,q RT-PCR检测显示HFD组小鼠肝脏内炎症因子如IL-1β,NF-κB p65,TNF-α表达量明显增加。2.与chow组小鼠相比,HFD组小鼠肝脏脂肪酸合成相关基因、TG合成相关基因、脂质摄取相关基因表达增加;而脂质分解相关基因ATGL表达下降。二、miR-124a对肝细胞内脂质沉积和炎症反应的作用及机制1.0.05m M,0.1m M PA干预HL-7702细胞24h,细胞内脂质沉积呈浓度依赖性增加,ATGL在脂肪变肝细胞内蛋白表达下降。2.与chow组相比,HFD组小鼠肝脏组织中miR-124a,miR-34a和miR-28a-5p表达显著增加;miR-124a、miR-148a、miR-148b、miR-152和miR-485可结合ATGL m RNA 3’端非编码区(UTR),并且在脂肪变肝细胞中miR-148a、miR-148b和miR-152表达下降,而miR-124a表达水平明显升高。3.miR-124a与ATGL 3’UTR存在保守结合位点,研究证实miR-124a可以直接抑制ATGL的转录和翻译,抑制miR-124a表达可以促进ATGL/Sirt1蛋白表达,进而抑制肝细胞内脂质沉积和炎症因子的表达。三、利拉鲁肽对HFD诱导的NAFLD小鼠的影响及机制1.利拉鲁肽可明显改善HFD组小鼠肝脏重量、肝功能、血糖和胰岛素的敏感性。2.利拉鲁肽促进HFD组小鼠肝脏组织内ATGL/Sirt1信号蛋白的表达,改善HFD组小鼠肝脏组织脂质沉积,并抑制炎症因子表达。3.利拉鲁肽抑制HFD组小鼠肝脏组织中miR-124a的表达。四、利拉鲁肽对PA诱导的肝细胞脂肪变的作用及机制1.利拉鲁肽干预脂肪变肝细胞后,ATGL和Sirt1蛋白表达增加,NF-κB p65向细胞核内转移减少,炎症因子的表达下降。2.过表达miR-124a可以抑制利拉鲁肽对ATGL/Sirt1表达的促进作用,阻断利拉鲁肽对肝细胞脂质沉积和炎症浸润的改善作用。3.肝细胞过表达miR-124a的同时,给予利拉鲁肽干预,NF-κB p65向细胞核内转移增加,炎症信号激活。结论:1.HFD组小鼠肝脏中ATGL蛋白表达水平下降,出现代谢紊乱以及肝脏内脂质沉积和炎性浸润;2.miR-124a通过直接抑制下游靶点ATGL m RNA的表达,促进肝细胞内脂质沉积和炎症反应;3.利拉鲁肽通过促进肝脏组织内ATGL/Sirt1的表达,从而抑制NAFLD的发生发展;4.利拉鲁肽通过抑制miR-124a的水平上调ATGL/Sirt1的表达,从而抑制肝细胞内脂质沉积和炎症反应,达到改善NAFLD的作用。