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造血干细胞(Hematopoietic Stem Cells,HSCs)是一类重要的成体干细胞,具有两个重要的特征:一是高度自我更新能力,通过不对称分裂产生与自身相同的子代HSCs;二是多向的分化发育潜能,继续分化成为多潜能的造血祖细胞(Multipotent Progenitors,MPPs),并逐级分化为共同淋巴系祖细胞(Common Lymphoid Progenitors,CLPs)或共同髓系祖细胞(Common Myeloid Progenitors,CMPs),淋巴系祖细胞进而发育成熟为T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞,而髓系祖细胞继续发育为粒细胞(Granulocyte)、巨噬细胞(Macrophage)以及红系的红细胞(Erythrocyte)和血小板(Platelet)等各种成熟的血细胞,以维持机体的造血稳态和免疫系统平衡。HSCs的分化发育过程受到包括Wnt、Notch、BMP及mTOR等多种信号通路在内的网状调控,其中Wnt信号通路一直是血液系统研究领域中的热点和前沿。Wnt信号通路包括经典通路(Canonical Pathway or Wnt/β-catenin Pathway)和非经典通路(Noncanonical Pathway)。多项研究表明,经典Wnt信号通路对HSCs的发育和功能具有重要的调控作用,但是通过不同的过表达和敲除模型以及实验系统得到的结论并不一致。本研究通过在小鼠HSCs发生阶段,特异性敲除辅助受体 Lrp5 和 Lrp6(Low-density Lipoprotein Receptor-related Proteins 5 and 6,Lrp5 and Lrp6)基因来阻抑经典Wnt信号通路,检测敲除小鼠HSCs分化和发育情况,明确Lrp5和Lrp6在HSCs分化发育及自我更新中的功能。本研究利用在血液系统中特异表达的Vav-Cre小鼠与Lrp5fl/fl和Lrp6fl/fl小鼠,配鼠获得野生型 Vav-Cre Lrp5+/+Lrp6+/+(WT)、Lrp5 敲除 Vav-Cre Lrp5fl/fl Lrp6+/+(Lrp5KO)、Lrp6 敲除 Vav-Cre Lrp5+/+Lrp6fl/fl(Lrp6KO)以及 Lrp5 和 Lrp6 双敲除 Vav-Cre Lrp5fl/fl Lrp6fl/fl(dKO)四种基因型小鼠。通过流式细胞术检测HSCs及各个发育阶段和成熟细胞亚群的发育情况,结果显示:在血液系统特异性删除Lrp5和Lrp6基因后,淋巴系和髓系细胞的发育基本没有受到影响,但dKO小鼠骨髓中HSCs的比例与野生型小鼠相比显著降低,提示Lrp5和Lrp6可能对HSCs的维持有重要作用。进一步通过竞争性移植和系列性移植实验对Lrp5和Lrp6缺失后小鼠的HSCs进行功能分析,发现dKO小鼠的HSCs在外周血重建的能力上显著降低;连续四代系列性移植实验结果显示dKO小鼠的HSCs自我更新能力减弱。脾脏中的集落形成实验显示,dKO小鼠HSCs在脾脏中形成的集落个数显著降低,说明Lrp5和Lrp6基因对HSCs的归巢具有重要作用。综上,初步分析结果表明缺失Lrp5和Lrp6基因小鼠的HSCs长期造血重建能力显著下降,HSCs的自我更新和分化发育能力显著下降,提示Lrp5和Lrp6在HSCs进行正常的分化发育及自我更新中发挥重要功能。为进一步分析Lrp5和Lrp6基因缺失影响HSCs的原因,本研究对dKO小鼠的HSCs的增殖、凋亡和细胞周期进行深入分析,发现在Wnt信号通路受到阻抑的情况下,dKO小鼠的HSCs凋亡无显著变化;HSCs中BrdU+的细胞减少,表明Lrp5和Lrp6基因缺失后小鼠HSCs增殖减慢;dKO小鼠的HSCs处于G0期的增多,处于G1期相应减少,说明处于静息状态的HSCs增多。这些数据显示Lrp5和Lrp6基因确实抑制HSCs增殖和分裂,使细胞周期减缓,进而影响HSCs的正常分化和发育。为揭示Lrp5和Lrp6基因缺失影响HSCs的分化和发育的相关机制,利用流式分选WT和dKO小鼠骨髓中的HSCs进行RNA-seq分析。高通量数据分析显示与WT小鼠的HSCs相比,dKO小鼠HSCs中共有437个上调基因,532个下调基因。进一步对差异基因进行GO和KEGG注释分析,可以富集到与DNA复制以及细胞周期的信号通路上。进一步利用qPCR验证差异基因,发现Egr1、Cdkn1a、Nr4a1、Gata2、Junb和Btg2等基因的表达上调,Ccna2、Ranbp1以及Ran等基因表达下调,这些基因的变化趋势与RNA-seq分析结果一致。基于上述实验数据和已有文献报道,HSCs缺失Lrp5和Lrp6后的细胞周期减缓,是由于Egr1、Junb和Cdkn1a等基因表达上调造成的。在下一步的研究中,将利用shRNA和逆转录病毒过表达载体进行上述候选基因的补偿验证,以期更精确的解析Lrp5和Lrp6在HSCs分化发育以及细胞周期的调控的分子机制。综上,我们通过条件删除Lrp5和Lrp6基因构建了实现阻抑经典Wnt信号通路的小鼠模型。分析发现dKO小鼠的HSCs数目减少,并且HSCs在归巢、分化和重建功能上出现缺陷,而这些功能上的缺陷是因为HSCs的增殖减慢、细胞周期减缓造成的。结合RNA-seq和qPCR等数据结果发现,在dKO小鼠的HSCs中有大量的与细胞周期和增殖相关的基因出现了差异,而这些基因的发现都值得进一步深入研究,以明确经典Wnt信号通路对HSCs的精细调控机制。本研究的结果揭示Lrp5和Lrp6参与的经典Wnt信号通路正向调节HSCs的分化发育与功能,不仅为HSCs的调控网络提供了新的实验证据,也为利用经典Wnt信号通路下游相关因子作为血液疾病的临床诊疗靶点奠定了基础。