随着生活水平日益提高,糖尿病(DM)已经成为最常见的威胁人类和动物健康的内分泌代谢紊乱性疾病,且人和动物患糖尿病的症状相似,均伴随着严重并发症的发生。其中,糖尿病性骨质疏松(DOP)已然成为目前讨论的热点问题。DOP是一种系统性的代谢性骨病,是以骨量减少、骨质微观结构退化为特征的全身性骨骼疾病。目前发现DOP与高血糖症、钙磷代谢紊乱和胰岛素缺乏等因素有关。然而,其发病机制尚不清楚,严重影响其有效防治。DOP与体内炎症存在一定的联系。活性氧(ROS)是氧正常代谢的天然副产物,而高浓度ROS却会扰乱氧化剂与抗氧化剂的平衡,进而导致炎性疾病的发生。NLRP3炎性小体是一种蛋白质复合物,研究发现它不仅与炎性疾病有关,而且与许多代谢性疾病有关,并发现NLRP3炎性小体在机体骨吸收中起到非常重要的作用。核因子κB(NF-κB)是一种转录因子,可调节多个基因的表达并控制各种细胞功能,包括炎症信号传导等。丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)可以控制多种细胞活动,包括基因表达、有丝分裂等。特别是,MAPKs中ERK、p38和JNK在调节炎症和免疫反应中起重要作用。巨噬细胞是关键的免疫细胞,当组织受到损害时,中性粒细胞会迅速蓄积并经历凋亡而通过巨噬细胞清除凋亡细胞的过程称为胞葬作用。未能清除的凋亡细胞会加剧体内的炎症发生,因此胞葬作用在调节机体炎症反应以及促进炎症消退中起到关键作用。破骨细胞是一种巨大的多核细胞,起源于单核巨噬细胞/单核系造血前体细胞,被认为是治疗骨质疏松的靶细胞之一,在骨吸收过程中发挥重要作用。而伴侣动物的自发糖尿病模型较啮齿动物与人类临床糖尿病更相似,并且犬和人类有更相似的染色体和基因结构,更合适作为人类疾病转化医学模型。因此本研究以破骨细胞为靶细胞,以人工诱导糖尿病性骨质疏松大鼠和自发糖尿病性骨质疏松犬为疾病模型,连同人医临床样本为对象,考察高糖是否能够通过破骨细胞ROS的产生、NLRP3炎性小体介导的炎症激活及胞葬作用被抑制共同增强破骨细胞骨吸收,并且在分子以及病理水平上深入探讨了人和动物糖尿病性骨质疏松症的发病机制。首先,我们在国内外首次发现破骨细胞NLRP3炎性小体介导的炎症激活是糖尿病性骨质疏松的发病因素。利用倒置显微镜对分离的破骨细胞诱导情况进行检测;借助荧光酶标仪对ROS产生情况进行探查;通过Western blot技术对炎症相关通路蛋白MAPKs(p-ERK、p-p38、p-JNK)、NF-κB(核NF-κB、p-IκB、IKK)以及NLRP3炎症小体(ASC、Caspase-1、IL-18、IL-1β、NLRP3)的表达水平进行分析;使用ELISA对IL-18、IL-1β的分泌情况进行考查;应用各通路抑制剂处理探究ROS、MAPKs通路、NF-κB通路和NLRP3炎症小体之间的上下游关系。结果表明,经TRAP染色证实,分离到的SD大鼠骨髓巨噬细胞(BMMs)经M-CSF和RANKL诱导后得到的细胞均为成熟的破骨细胞;高糖能够诱导破骨细胞ROS产生且该ROS产生呈NOX2依赖性;高糖能够诱导破骨细胞MAPKs通路蛋白、NF-κB通路蛋白和NLRP3炎症小体蛋白的表达以及IL-18、IL-1β的分泌,且以上最佳诱导时间为36 h,最佳诱导浓度为35 mM;DPI(ROS抑制剂)能够显著抑制MAPKs通路蛋白、NF-κB通路蛋白和NLRP3炎性小体蛋白表达以及IL-18、IL-1β分泌;且PD98059(ERK抑制剂)、SP600125(JNK抑制剂)和SB203580(p38抑制剂)能够显著抑制NF-κB通路蛋白和NLRP3炎症小体蛋白表达以及IL-18、IL-1β分泌,但不能抑制ROS产生;BAY11-7082(NF-κB抑制剂)能够显著抑制NLRP3炎症小体蛋白表达以及IL-18、IL-1β分泌,但不能抑制ROS的产生以及MAPKs通路蛋白表达;而Ac-YVAD-cmk(Caspase-1抑制剂)对其它通路均不存在抑制作用。综上所述,高糖通过诱导破骨细胞ROS产生并激活MAPKs/NF-κB/NLRP3炎症通路诱导破骨细胞炎症发生,且ROS产生发生在MAPKs、NF-κB和NLRP3上游;MAPKs位于NF-κB和NLRP3上游;而NF-κB位于NLRP3炎性小体上游。其次,在国际上,我们率先阐明破骨细胞炎症激活以及胞葬作用抑制共同促进破骨细胞骨吸收能力的增强,是糖尿病性骨质疏松发生的主要因素。应用流式细胞术对破骨细胞胞葬作用的发生情况进行检测;利用ELISA对LXA 4的表达情况进行考查;借助Western blot技术对MertK蛋白的表达水平进行分析,通过Ac-YVAD-cmk处理探究高糖诱导破骨细胞炎症发生与胞葬作用之间的关系;使用扫描电子显微镜对破骨细胞骨吸收能力进行观察,并采用Ac-YVAD-cmk、胰岛素和LXA 4处理及基因沉默NLRP3解析胞葬作用与炎症的发生与骨吸收之间的关系。结果显示,高糖能够显著抑制破骨细胞胞葬作用的发生和LXA 4的分泌以及MertK蛋白的表达,而Ac-YVAD-cmk处理能够显著逆转高糖的上述抑制作用;高糖能够诱导破骨细胞骨吸收能力的增强,而Ac-YVAD-cmk、胰岛素和LXA 4处理、基因沉默NLRP3却能够显著抑制该增强。综上所述,高糖通过激活破骨细胞NLRP3炎性小体介导的炎症及抑制胞葬作用共同增强破骨细胞骨吸收。再次,我们通过链脲佐菌素(STZ)诱导建立了糖尿病性骨质疏松大鼠模型,在体内验证了破骨细胞炎症反应以及胞葬作用被抑制是糖尿病性骨质疏松发生的机制,并且在国内外率先发现胞葬作用增强剂LXA 4能够作为治疗糖尿病性骨质疏松的潜在药物。利用ELISA对建模鼠检测破骨细胞及骨组织标记物;采用双能X射线吸收仪探查骨密度和骨矿盐;应用HE染色考查骨小梁等骨微结构完整性;借助TRAP染色测定骨组织中破骨细胞含量;通过激光共聚焦显微镜对骨组织中Cathepsin K、p-ERK、NF-κB、NLRP3以及MertK进行共定位;使用Western blot以及ELISA分析骨组织炎症相关通路蛋白p-ERK、p-p38、p-JNK、核NF-κB、p-IκB、IKK、ASC、Caspase-1、IL-18、IL-1β、NLRP3和MertK蛋白以及炎症细胞因子IL-18、IL-1β和TNF-α表达情况。结果表明,STZ建模组鼠血清中TRACP-5b、Cathepsin K以及尿液中脱氧吡啶啉的含量显著增加,而胰岛素和骨钙素的含量显著降低,且组织中骨密度和骨矿盐的含量也显著降低;病理组织切片显示,STZ建模组骨组织中各个骨小梁之间更为离散,数目减少并排列不整齐,且破骨细胞的含量显著增多;STZ建模组组织中破骨细胞能够与炎症通路相关蛋白以及MertK蛋白进行共定位;各炎症通路相关蛋白表达量以及炎性细胞因子的分泌量显著增加,但MertK表达显著降低,而LXA4和胰岛素处理均逆转了上述现象。综上所述,破骨细胞NLRP3炎症通路激活以及胞葬作用被抑制介导了大鼠糖尿病性骨质疏松发生。最后,我们针对人和犬糖尿病性骨质疏松临床病例样本,更进一步验证了在体内破骨细胞炎症反应以及胞葬作用被抑制是糖尿病性骨质疏松发生的机制。我们用与上述STZ诱导糖尿病性骨质疏松大鼠模型相同的实验方法,分别对人和犬的糖尿病性骨质疏松临床样本进行相关指标的检测和分析。结果发现,糖尿病性骨质疏松症病人和病犬体内骨组织中破骨细胞数量显著增多,且均能检测到炎症的激活以及胞葬作用的抑制。此结果与前面的体外实验结果及与STZ诱导糖尿病性骨质疏松大鼠模型的相应结果均一致。总之,本研究结果表明,高糖激活ROS/MAPKs/NF-κB/NLRP3炎症通路以及抑制胞葬作用介导破骨细胞骨吸收能力的增强是糖尿病性骨质疏松症的主要发病原因,并且发现胞葬作用增强剂LXA 4能够作为治疗糖尿病性骨质疏松的潜在药物。这些结果为更深入地探究糖尿病性骨质疏松症的发病机理以及为以后有针对性地治疗糖尿病性骨质疏松症奠定了重要的理论基础。