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目的:探讨内脂素及胰岛素对PCOS(Polycystic Ovary Syndrome)患者子宫内膜间质细胞的增殖作用,内脂素及胰岛素对不同增生程度的PCOS患者子宫内膜间质细胞增殖作用的差别,进一步研究内脂素及胰岛素与PCOS患者子宫内膜病变进展的关系;探讨内脂素影响PCOS患者子宫内膜间质细胞增殖作用的可能途径。方法:收集2017年1月至2017年8月在天津医科大学总医院因子宫不规则出血就诊的PCOS患者的子宫内膜组织标本,分为PCOS正常内膜组、PCOS无非典型增生内膜组和PCOS非典型增生/癌变组,每组各4例;同时收集因男方因素拟行IVF助孕的非PCOS患者的正常子宫内膜4例作为对照组,所有患者均排除其他疾病。提取子宫内膜间质细胞进行原代细胞培养,并对培养细胞进行免疫细胞化学鉴定;对不同分组细胞按照内脂素组、胰岛素组、内脂素+胰岛素共同作用组分别对不同细胞进行刺激,用MTT法检测不同刺激对细胞增殖的影响。选择各组中培养状况良好的子宫内膜间质细胞,应用浓度为200ng/ml内脂素分别对其进行0min、5min、15min、30min、1h、2h刺激,采用Western Blot方法检测不同子宫内膜间质细胞的信号通路关键蛋白AKT、P-AKT、ERK1/2及P-ERK1/2的表达情况,分析内脂素对不同组别子宫内膜间质细胞PI3K及MAPK信号通路关键蛋白AKT、P-AKT、ERK1/2及P-ERK1/2的表达水平的影响。结果:1、子宫内膜间质细胞培养与免疫细胞化学的结果分离出的子宫内膜间质细胞在1-2h之内基本贴壁,细胞大部分排列分散,偶有3-5个聚集,呈现三角形或多角形。常规数量接种后约4-5天可以长满瓶底,此时细胞形态呈现梭形、纺锤形状,细胞平行排列整齐成束,部分细胞可表现为成纤维细胞形态。间质细胞传代较为容易,常规消化后不易死亡,传代7-9代仍可以保持细胞形态及增殖特性。培养后的间质细胞经特异Vimentin蛋白抗体染色表现:间质细胞Vimentin染色呈现阳性,细胞浆染为棕色,细胞核为蓝色。经角蛋白CK19染色的爬片,细胞浆未着色,细胞核染色为蓝色。2、内脂素、胰岛素对PCOS子宫内膜间质细胞增殖作用的影响(1)内脂素对子宫内膜间质细胞的增殖作用内脂素作用于各组子宫内膜间质细胞24、48、72h后,PCOS正常内膜组细胞增殖率(0.903±0.278、1.143±0.186、1.343±0.598)随时间延长而明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05);而对照组细胞增殖率(0.781±0.216、0.890±0.202、0.901±0.124)、PCOS无非典型增生组细胞增殖率(1.078±0.299、1.005±0.216、1.088±0.252)和非典型增生/癌变组细胞增殖率(0.911±0.185、0.806±0.188、0.968±0.114),随内脂素作用时间延长有增殖趋势,但没有统计学差异。内脂素刺激24h后,四组之间细胞增殖率比较没有统计学差异;刺激48h及72h后,PCOS正常内膜组细胞增殖率明显高于对照组、PCOS无非典型增生组和非典型增生/癌变组,差异具有统计学意义(P<0.05);PCOS无非典型增生组和非典型增生/癌变组较对照组无统计学差异。(2)胰岛素对子宫内膜间质细胞的增殖作用胰岛素作用于各组子宫内膜间质细胞24、48、72h后,对照组(0.739±0.216、0.884±0.107、1.004±0.204)及PCOS正常内膜组细胞增殖率(0.968±0.278、1.130±0.267、1.497±0.635)随时间延长而明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);而PCOS无非典型增生组(0.897±0.299、1.105±0.220、1.099±0.228)和非典型增生/癌变组(1.158±0.185、1.120±0.178、1.075±0.128),随胰岛素作用时间延长有增殖趋势,但无统计学差异。胰岛素刺激24h后,PCOS正常内膜组细胞增殖率、非典型增生/癌变组细胞增殖率高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);刺激48h后,四组之间细胞增殖率比较没有统计学差异;刺激72h后,PCOS正常内膜组细胞增殖率高于对照组、PCOS无非典型增生组、非典型增生/癌变组,差异具有统计学意义(P<0.05);PCOS无非典型增生组和非典型增生/癌变组较对照组无统计学差异。(3)内脂素+胰岛素对子宫内膜间质细胞增殖的影响内脂素+胰岛素共同作用于各组子宫内膜间质细胞24、48、72h后,对照组(0.662±0.257、0.811±0.082、0.929±0.190)及PCOS正常内膜组细胞增殖率(0.905±0.232、1.026±0.278、1.493±0.316)随作用时间延长而明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05);而PCOS无非典型增生组(0.971±0.411、1.041±0.272、1.184±0.310)和非典型增生/癌变组(0.972±0.164、0.958±0.171、1.056±0.148)细胞增殖率随作用时间延长有增殖趋势,但没有统计学差异。内脂素+胰岛素共同刺激24h、48h后,四组之间细胞增殖率比较没有统计学差异;刺激72h后,PCOS正常内膜组细胞增殖率高于对照组、PCOS无非典型增生组和非典型增生/癌变组,差异具有统计学意义(P<0.05)。3、子宫内膜间质细胞PI3K/AKT信号通路关键蛋白表达情况:比较实验组与对照组AKT、P-AKT水平:AKT蛋白相对表达量在PCOS正常内膜组(55.841±10.524)、PCOS EH组(47.973±10.094)和PCOS AH/EC组(36.745±4.191)较对照组(38.189±7.145)相比均没有统计学差异。PCOS组正常内膜组(36.175±1.642)、PCOS EH组(33.309±3.129)、PCOS AH/EC组(35.181±0.414)的P-AKT蛋白相对表达量均高于对照组(24.566±1.688),差异具有统计学意义(P<0.05)。加入内脂素刺激细胞后,各PCOS组AKT蛋白相对表达量在各时间点,较对照组均无统计学差异;PCOS正常内膜组P-AKT相对表达量在5min、15min、30min、1h、2h各时间点高于对照组细胞(P<0.05);PCOS EH组和PCOS AH/EC组细胞仅在加药5min、15min时,P-AKT的相对表达量高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。4、子宫内膜间质细胞MAPK信号通路关键蛋白表达情况:比较四组ERK1/2、P-ERK1/2水平:PCOS正常内膜组(49.868±7.145)、PCOS无非典型增生组(47.944±14.157)、PCOS非典型增生/癌变组(46.377±13.344)较对照组ERK蛋白相对表达量(55.599±0.790)相比均没有统计学差异。P-ERK1/2蛋白相对表达量在PCOS正常内膜组(39.433±9.750)、PCOS无非典型增生组(29.091±5.703)、PCOS非典型增生/癌变组(28.441±7.743)较对照组相对表达量(28.365±5.560)相比均没有统计学差异。加入内脂素刺激后,各PCOS组ERK1/2蛋白相对表达量在各时间点,较对照组均无统计学差异。PCOS正常内膜组细胞P-ERK1/2相对表达量在15min、30min、1h、2h时均高于相应时间点对照组,且差异具有统计学意义(P<0.05);PCOS无非典型增生组和PCOS非典型增生/癌变组细胞P-ERK相对表达量较对照组相应时间点无统计学差异。结论:1.内脂素或胰岛素单独和共同作用于子宫内膜间质细胞,在PCOS正常内膜组间质细胞增殖率随作用时间延长而增加,具有时间依赖性;2.内脂素或胰岛素单独和共同作用于子宫内膜间质细胞,在PCOS正常内膜组间质细胞的增殖作用最明显,提示内脂素与胰岛素对子宫内膜间质细胞的影响可能发生在PCOS患者子宫内膜上皮病变之前;3.内脂素或胰岛素单独和共同作用对PCOS无非典型增生组和PCOS非典型增生/癌变组间质细胞的增殖作用不明显,结合课题组前期研究提示在PCOS子宫内膜病变的后期,内脂素和胰岛素可能并非通过直接促进间质细胞增殖而导致子宫内膜病变。4.PCOS各组子宫内膜间质细胞PI3K及MAPK信号通路关键蛋白P-AKT和P-ERK表达较对照组增高,提示PCOS患者子宫内膜间质细胞内存在PI3K及/MAPK信号通路的活化;5.内脂素可以通过激活子宫内膜间质细胞PI3K/AKT及MAPK信号转导通路关键蛋白,促进PCOS子宫内膜间质细胞增殖。6.内脂素和胰岛素对PCOS正常子宫内膜间质细胞有促进增殖作用,推测子宫内膜间质细胞增殖或信号通路改变后,间质细胞相关的核转录因子和分泌的蛋白可能发生变化,通过旁分泌形式改变子宫内膜的微环境,进而促进PCOS患者子宫内膜腺上皮细胞增生及向恶性转化,但具体作用机制仍需进一步研究。