猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是世界范围内严重威胁猪生产的最具经济破坏性的疾病之一,它以导致母猪的生殖功能衰竭和后代仔猪的呼吸道症状及高死亡率为主要特征,具有持续性感染、免疫抑制和抗体依赖性增强作用(ADE)等免疫学特征。此病是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus,PRRSV)引起。PRRSV具有非常狭窄的细胞嗜性,仅表现出对单核/巨噬细胞系细胞的嗜性。病毒主要感染肺、淋巴组织和胎盘中某些分化的巨噬细胞并在细胞中复制,特别是对猪肺泡巨噬细胞(PAMs)最易感。因此,本研究采用基于PAM细胞的抗PRRSV中和抗体的检测更为符合临床特点。在PRRSV感染宿主后首先引起先天性免疫反应,先天性免疫反应主要是由机体的屏障结构、吞噬细胞、正常组织和体液中的抗菌物质和炎症因子组成。感染后的猪机体内的单核细胞和巨噬细胞被活化可分泌细胞因子IFN-α、TNF-α、和IL-1β等因子,这些因子具有杀菌、抑制病毒的复制和参与炎症反应的作用。因此,PRRSV感染后在不同的时间点测定血清中细胞因子的动态变化,可以为PRRSV诱导机体产生免疫机制的研究提供一些依据。为了以上研究本试验采用PRRSV VR2332毒株经滴鼻和注射途径感染仔猪,来检测血清中病毒的增殖规律、抗体的产生规律和IFN-α、TNF-α和IL-1β细胞因子的变化规律。本研究选取PRRS、猪瘟(CSF)、猪圆环(PCV2)和猪伪狂犬(PR)抗原与抗体检测均为阴性的9头20日龄的健康大白仔猪用于本试验。将9头仔猪随机分为3组,第一组为滴鼻组,第二组为注射组,第三组为对照组。滴鼻组和注射组分别滴鼻和肌肉注射感染5m L(抗原量5×105TCID50/m L);第三组对照组肌肉注射5m L的健康Mac-145细胞培养物。在感染后第0d、3d、7d、11d、15d、19d、23d、27d、31d、35d、39d和43d,3组所有仔猪进行前腔静脉采集凝血和抗凝血。凝血分离血清,用于PRRSV的拷贝数、ELISA抗体和中和抗体滴度的检测;抗凝血分离外周血淋巴细胞,用建立的荧光定量PCR方法检测IFN-α、TNF-α和IL-1β细胞因子。一、把PRRSV经滴鼻和注射两种途径感染猪后,分离血清检测PRRSV核酸,比较两种不同途径感染引起的病毒血症变化规律的差异。用不同时间点分离的样品血清,提取RNA,用RT-PCR方法与实时荧光定量PCR方法检测PRRSV核酸,其病毒核酸阳性检测结果一致。滴鼻组3头仔猪其中2头在感染后第3d,在血清中检测到了PRRSV,另1头在第7d也检测到了,病毒的拷贝数均大于103拷贝/μL,第15-19d病毒拷贝数达到高峰,可达到大于104拷贝/μL,第27d检测病毒核酸阴性,病毒血症消失;注射组在第3d,3头仔猪的血清均检测到了病毒,也已出现病毒血症,在第15-23d病毒拷贝数达到高峰,其中第19d病毒拷贝数可达到大于105拷贝/μL,其中1头仔猪病毒血症在第31d消失,另2头在第35d左右病毒血症消失。两组结果比较,注射组病毒拷贝数的增殖一直高于滴鼻组101-102倍,且病毒血症持续时间更长一些。试验结束后取两试验组的脾脏,颌下、腹股沟及肠系膜淋巴结和无菌收集PAM细胞检测PRRSV核酸,结果表明两试验组的颌下、腹股沟及肠系膜淋巴结和无菌收集PAM细胞均检测到了PRRSV阳性,且注射组的拷贝数高于滴鼻组,这说明感染后的猪体内PRRSV是一直存在的。二、把PRRSV经滴鼻和注射两种途径感染猪后,分离血清检测ELISA抗体和中和抗体,比较两种不同途径感染诱导抗体产生规律的差异。用不同时间点分离的样品血清,检测ELISA抗体。两试验组仔猪感染PRRSV后,均在第27d时检测到血清中抗PRRSV抗体为阳性,随后抗体水平一直处于逐渐上升趋势,一直持续到试验结束。滴鼻组在第27d到第43d间ELISA抗体一直保持基本相同水平,注射组在第27d后抗体水平在逐渐上升,且第35d到第43d间ELISA抗体值比滴鼻组高。两组试验结果比较,注射组血清中抗体产生的时间比滴鼻组早,并且抗体滴度也比滴鼻组高。本研究采用基于PAM细胞微量中和试验,检测PRRSV VR2332毒株感染后的中和抗体水平,其检测结果是根据70%病毒的抑制标准来确定的。滴鼻组选取在感染后第3d、11d、19d、27d、35d、43d做中和试验,检测其中和抗体水平,试验结果显示,在第35d之前中和抗体滴度都<1:2,第43d中和抗体滴度为1:2,此结果表明滴鼻组出现中和抗体水平很低。注射组结果显示感染后第3d、11d和19d的中和滴度均<1:2,第27d、35d、43d的中和滴度分别为1:4、1:8、1:4。此结果表明,注射组血清中产生中和抗体处于逐渐上升趋势,到43d时又降低了一个滴度。两组试验结果比较,注射组产生的中和抗体滴度比滴鼻组早且高。三、把PRRSV经滴鼻和注射两种途径感染猪后,取抗凝血分离外周血淋巴细胞检测IFN-α、TNF-α和IL-1β细胞因子的m RNA转录水平,比较两种不同途径感染诱导细胞因子变化规律的差异。对于PRRSV感染后细胞因子的检测,本研究建立了荧光定量PCR的检测方法。其中IFN-αm RNA转录水平的检测结果表明:滴鼻组与对照组比较在感染后第3d转录水平迅速降低,在第7d时基本与对照组水平相同,之后上升到第15d时转录水平达到最高,随之第19d到第23d低于对照组,到第27d之后缓慢上升,与对照组基本趋于同一水平;注射组与对照组比较在第7d迅速下降,之后一直呈上升趋势到第15d高于对照组,第19d时转录水平达到最高,随之下降低于对照组,在第35d后基本与对照组趋于相平。两组试验结果相比,滴鼻组出现IFN-αm RNA转录水平降低的时间比注射组早,且滴鼻组在第27d时与对照组基本在趋于同一水平上,而注射组在第35d后与对照组基本趋于同一水平。TNF-αm RNA转录水平检测结果表明:滴鼻组与对照组比较在感染后第3d迅速上升显著高于对照组,在第7d达到最高,直至第19d转录水平都比较高。注射组与对照组比较在感染后也呈现上升趋势显著高于对照组,在第7-23d上升趋势明显且在第15d达到最高,两组所有时间段内的转录水平都显著高于对照组。两组试验结果相比,滴鼻组的TNF-αm RNA转录水平比注射组提前上升,最高值也出现的早,但在第15d之前滴鼻组比注射组的转录水平高,反而在第15d后注射组一直显著高于滴鼻组直至试验结束。IL-1βm RNA转录水平检测结果表明:滴鼻组的IL-1βm RNA转录水平与对照组比较在感染后第3d检测就急剧上升极显著高于对照组,第7d达到最高,之后处于下降趋势直到第19d与对照组基本处于同一水平;注射组在感染后检测结果的趋势与滴鼻组基本一样。两组结果比较,在第3d时滴鼻组IL-1βm RNA转录水平比注射组高,注射组在第7d时达到最高并且高于滴鼻组,两组在第19d后都与对照组基本处于相同水平。之后本研究又通过采用SPSS18.0软件中Pearson回归分析两试验组各时间点的PRRSV拷贝数与对应细胞因子m RNA转录水平的相关性,两试验组结果比较滴鼻组各时间点的PRRSV拷贝数与细胞因子m RNA转录水平之间的相关性比注射组高,表明滴鼻感染后PRRSV增殖的变化对IFN-α、TNF-α和IL-1β细胞因子的产生更可能存在着一些复杂的关系。