拟南芥氧甾醇结合蛋白家族的表达纯化与结晶

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氧化甾醇结合蛋白(OSBP)及其相关蛋白(OSBP-related proteins,ORPs)共同构成了 ORP家族,是一类脂质转运蛋白(LTP),该家族保守地存在于酵母、植物、哺乳动物中,并在信号传递与脂质代谢方面发挥着重要的作用。在动物和酵母体系中,该家族多个成员被报道通过其OSBP相关结构域(OSBP-related domain,ORD)结合、转运固醇和磷脂,结构生物学研究也阐明了其识别不同配体的分子机制。植物中同样存在ORP家族,但对于它是否具有结合并转运脂质的能力不甚明了,因此我们围绕这一方向展开了相关实验。本论文选择了拟南芥氧甾醇结合相关蛋白AtORPs(Arabidopsis Thaliana OSBP-related proetins)作为研究对象。目前一共发现了 12种AtORPs,根据进化上的同源关系,可以将它们分为4个亚家族(AtORP1-4)。AtORPs与人源和酵母中的ORP类似,都包含一个保守的ORD结构域,该结构域大约包含400个氨基酸,我们对其进行了以下研究:(1)体外构建大量AtORP1-4亚家族各个成员的ORD结构域重组克隆,在大肠杆菌体系中表达,筛选可溶性蛋白片段;(2)运用亲和层析、离子交换层析及凝胶过滤层析等蛋白纯化方法,制备高纯度蛋白;(3)通过蛋白脂质印迹实验(lipid overlay)初步检测AtORP1-4亚家族ORD识别脂质的特异性,发现它们对不同种类的脂质有不同程度的结合能力;(4)通过脂质结合实验定量检测了 AtORP 1-4亚家族ORD结合脱氢麦角固醇(DHE)、磷脂酰肌醇磷酸(PIPs)、磷脂酰丝氨酸(PS)的能力,发现不同亚家族成员结合脂质的特异性及能力不尽相同;(5)进行了 AtORP1-4亚家族成员的初步结晶实验,目前获得了 AtORP1A-ORD和AtORP1C-ORD的微晶。
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