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乙型病毒性肝炎(乙肝)是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的疾病,在我国广泛流行,随着科学家对乙肝致病机制的深入研究,人们逐渐认识到乙肝相关肝损伤与宿主免疫应答密切相关。山豆根是豆科植物越南槐Sophora tonkinensis Gapnep.的干燥根及根茎,是临床上治疗慢性乙肝的常用中药之一。前期研究表明,山豆根中主要化学成分氧化苦参碱(oxymatrine OMT)具有调节免疫、保肝降酶的作用,但是目前国内外对其保肝机制的研究还较少。为此本课题采用刀豆蛋白(Concanavalin A Con A)模型模拟乙肝相关免疫性肝损伤,从免疫调控和抗氧化应激两个角度探讨OMT对该模型的保护作用及可能机制,以期为阐释OMT治疗乙肝的机制提供前期数据支持。第一部分基于免疫调控的氧化苦参碱抑制Con A诱导小鼠肝损伤作用研究目的:从免疫调控角度研究氧化苦参碱(OMT)抑制Con A诱导小鼠肝损伤作用及其机制方法:1.Con A诱导小鼠急性肝损伤模型的建立:取5-6周龄,18-22g Balb/c小鼠,随机分成空白组,Con A 5 mg·kg-1组,Con A 10 mg·kg-1组,Con A 15 mg·kg-1组,Con A 20 mg·kg-1组,每组6只,空白组尾静脉注射生理盐水,其余组尾静脉注射Con A。8h后,小鼠摘眼球取血,检测血清丙氨酸转氨酶(ALT)活性;取肝组织大叶进行HE染色。2.OMT对Con A诱导的小鼠肝损伤的干预作用取5-6周龄,18-22 g Balb/c小鼠,随机分成空白组(A组),Con A15 mg·kg-1组(B组),双环醇(阳性药)156 mg·kg-1治疗组(C组),OMT60 mg·kg-1治疗组组(D组),OMT 120 mg·kg-1治疗组(E组),每组6只,B、C、D、E组分别尾静脉注射15 mg·kg-1的Con A,造急性肝损伤模型,同时d、e组分别腹腔注射检测omt进行干预,c组造模之前半小时灌胃给药,a组给相同剂量的生理盐水,8h后取样检测血清丙氨酸转氨酶(alt)和天门冬氨酸转氨酶(ast)活性以及血清总胆红素(tbil)的水平。取肝组织大叶进行he染色3.采用luminex多因子检测方法检测小鼠体内细胞因子的表达水平,筛选omt可能的免疫调控机制。4.采用流式细胞术检测脾淋巴细胞中th17细胞和treg细胞亚群的比例。结果:1.cona诱导小鼠急性肝损伤模型的建立:结果显示随着cona剂量的增加,alt值逐渐增加,当造模剂量达到15mg·kg-1时,alt值升高到1032.08±85.62u·l-1,肝组织切片he染色显示,cona5mg·kg-1组,肝组织未出现严重的死亡灶,只是在肝窦有明显的充血现象,汇管区有较轻微的炎症细胞浸润;cona10mg·kg-1组,肝窦充血明显,肝组织出现较严重的死亡灶,并且有轻微的炎症细胞浸润;cona15mg·kg-1组,肝窦充血明显,汇管区出现大量的炎症细胞浸润,并且出现片状的肝组织坏死区域;cona20mg·kg-1组,小鼠全部死亡。综上所述,当给予cona的造模剂量达到15mg·kg-1时,小鼠alt值升高明显,肝组织出现明显的片状死亡区域,因此本课题组采用此浓度造模进行后续实验。2.omt对cona诱导的小鼠急性肝损伤的治疗作用:2.1血清生化指标检测:与a相比,b组alt、ast、tbil值均显著升高(p<0.01)。与b组相比,c组alt值显著下降(p<0.05),未降低到正常值水平,ast和tbil降低,但无统计学差异(p>0.05);d组alt和tbil值显著降低(p<0.05),ast值降低,但无统计学差异(p>0.05);e组alt值显著降低(p<0.01),未降低到正常值水平,ast和tbil值均显著降低(p<0.05),未降低到正常值水平。2.2肝组织切片he染色结果:与a相比,b组肝细胞水肿,肝窦充血明显,汇管区出现大量的炎症细胞浸润,并且出现大面积肝组织坏死。与b组相比,c组肝窦充血未减轻,汇管区依然有大量的炎症细胞浸润,但组织坏死症状减轻;d组肝窦充血症状未减轻,汇管区炎症细胞浸润减轻,肝组织小灶样坏死;e组肝窦充血症状减轻,汇管区有少量炎症细胞浸润,肝组织小灶样坏死。3.omt对小鼠血清细胞因子的影响:与a组比,b组血清中白细胞介素17(il-17)的水平显著升高(p<0.01),白细胞介素10(il-10)的水平显著升高(p<0.01);与b组相比,e组血清中il-17的水平显著下降(p<0.01),il-10的水平显著上升(p<0.05)。这说明omt可能对辅助性t细胞17(th17)和调节性t细胞(treg)的分化有影响。4.omt对th17细胞和treg细胞的影响:与a相比,b组中与引起自身免疫反应,造成肝组织损伤的th17细胞比例显著上升(p<0.05);具有抑制自身免疫反应,保护肝组织损伤的treg细胞比例显著上升(p<0.05)。与b组相比,d组th17细胞比例均显著下降(p<0.05),e组th17细胞比例显著下降(p<0.05);d组treg细胞比例有所上升,但无统计学差异(p>0.05),e组treg细胞比例显著上升(p<0.05)。结论:omt通过抑制引起自身免疫反应,造成肝组织损伤的th17细胞的分化和促进具有抑制自身免疫反应,保护肝组织损伤的treg细胞的分化,从而实现其调节免疫,保肝降酶作用。第二部分基于抗氧化应激的氧化苦参碱抑制cona诱导小鼠肝损伤作用研究目的:从抗氧化应激角度研究氧化苦参碱(omt)抑制cona诱导小鼠肝损伤作用及机制方法:1.动物实验:在第一部分动物水平转氨酶及病理结果基础上检测各组小鼠肝脏组中与氧化应激相关的超氧化物歧化酶(sod)和谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)的活性;2.细胞实验:采用双氧水(h2o2)诱导肝实质细胞l02建立氧化应激损伤模型,在细胞水平上进一步研omt的抗氧化作用。cck-8(cellcounting kit-8)试剂盒检测OMT对L02细胞增殖活性的影响;H2O2诱导的L02细胞氧化应激模型条件的筛选;流式检测OMT对H2O2诱导的L02细胞凋亡率的影响;分析OMT对H2O2诱导的L02细胞内ROS水平、GSH-PX和SOD活性的影响,探讨OMT抗氧化机制。结果:1.动物实验:与空白组相比,模型组中SOD和GSH-PX的活性显著降低(P<0.05);与模型组相比,OMT 60mg·kg-1治疗组和OMT 120 mg·kg-1治疗组小鼠肝脏内SOD和GSH-PX活性均显著增强(P<0.01);OMT 120mg·kg-1治疗组小鼠肝脏内二者活性增强最为明显。2.细胞实验:CCK-8结果显示OMT在6.25μg·ml-1至100μg·ml-1的剂量范围内不同程度增强L02细胞增殖活性,当剂量范围大于200μg·ml-1时,L02细胞的增值活性降低,即对L02细胞产生毒性作用,因此本课题组选择6.25μg·ml-1、12.5μg·ml-1、25μg·ml-1、50μg·ml-1四个无毒剂量进行后续实验。流式细胞术检测结果表明OMT剂量在6.25μg·ml-1、12.5μg·ml-1、25μg·ml-1、50μg·ml-1时均可抑制H2O2诱导的L02细胞凋亡,且OMT剂量在12.5μg·ml-1时L02细胞的凋亡率最低;在上述四个剂量下,OMT能够抑制H2O2诱导的L02细胞内活性氧ROS水平的升高,并且增强GSH-PX和SOD的活性。结论:OMT通过增强肝细胞内GSH-PX酶和SOD酶的活性,进而促进GSH介导的活性氧的清除,减少ROS导致的肝细胞损伤,降低肝细胞凋亡率,达到保肝降酶作用。