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缺血性脑卒中是由于脑血管闭塞或狭窄所致的脑组织缺血缺氧,及脑细胞死亡,引起的以神经功能缺损为主要表现的病理生理过程。线粒体是生命活动能量代谢的主要场所,也是细胞缺血早期极易累计的细胞器之一,在脑缺血时线粒体分裂融合蛋白动态平衡被打破,从而线粒体正常功能受损引起细胞凋亡。依达拉奉是临床治疗急性脑缺血的早期使用药物,已经被证实能够显著减少脑梗死面积改善神经功能学评分,同时能够减少活性氧(ROS)的产生。因此本实验旨在探讨依达拉奉对大鼠局灶性脑缺血中Drp1及Mfn2动态变化的影响以及保护脑组织的作用机制。目的:制作大脑中动脉栓塞模型观察大鼠脑组织Drp1蛋白及mRNA、Mfn2蛋白及mRNA的表达及应用依达拉奉药物后的影响,探讨依达拉奉在大鼠早期急性脑缺血细胞中对Drp1及Mfn2动态变化的影响及其脑保护的作用机制。方法:1.将72只实验用雄性SD大鼠,按随机数字表法分成模型组、对照组及用药组三个大组。每大组实验大鼠又根据脑缺血持续时间的不同分成:1天组(n=8)、3天组(n=8)、7天组(n=8)三个亚组。对模型组及用药组的大鼠进行线栓栓塞法制做大脑中动脉栓塞大鼠模型,对对照组大鼠仅进行颈部切开及颈部血管分离。用药组大鼠在手术后30分钟给予依达拉奉药物腹腔注射,模型组以及对照组在同时间同方法给予同剂量的生理盐水。注射依达拉奉及生理盐水均为每天注射一次,用药直至取脑组织之日。2.采用Zea Longa法对各组SD大鼠进行神经功能缺损评分。分数在1到3分说明大鼠大脑中动脉栓塞模型制作成功,选取此类大鼠作为实验大鼠,对神经功能无缺损以及缺损过重的大鼠予以剔除。在实验过程中保证每组动物数不变。3.采用苏木精-伊红染色法观察各组大鼠大脑皮层的病理学变化。4.采用Western blot法检测各组大鼠缺血脑组织Drp1及Mfn2的蛋白表达情况。5.采用qRT-PCR法检测各组实验大鼠缺血脑组织Drp1及Mfn2的mRNA表达情况。结果:1.神经功能评分结果:对照组大鼠神经功能评分均为0分;模型组大鼠各时间点的评分分别为:2.80±0.11,2.83±0.12,2.90±0.13,用药组各观察时间点评分分别为:1.38±0.09,1.40±0.06,1.49±0.08。相较于模型组,在用药组的大鼠神经功能缺损评分显著下降(P<0.05)。2.苏木精-伊红染色法观察各组大鼠大脑皮层的病理学变化:模型组大鼠缺血脑组织神经细胞形态、结构改变,边界模糊,排列不规则,可见点片状坏死,部分神经元皱缩,其脑组织损伤程度随着缺血时间延长逐渐加重;用药组的实验大鼠大脑组织病理学损伤相较于模型组相同缺血时间点较轻;对照组大鼠脑组织细胞结构、形态正常,边界清晰,无破损神经细胞。3.Western blot法检测各组大鼠缺血脑组织Drp1及Mfn2的蛋白表达情况:模型组中各缺血时间点Drp1蛋白表达水平分别是:1d 0.72±0.06、3d 0.97±0.05、7d 1.57±0.06;对照组中各缺血时间点Drp1蛋白表达水平分别是:1d 0.46±0.03、3d 0.42±0.04、7d 0.41±0.04;用药组中各缺血时间点Drp1蛋白表达水平分别是:1d 0.58±0.04、3d 0.73±0.03、7d 0.97±0.05。模型组中各缺血时间点Mfn2蛋白表达水平分别是:1d 2.18±0.17、3d1.64±0.14、7d 1.02±0.09;对照组中各缺血时间点Mfn2蛋白表达水平分别是:1d 0.72±0.02、3d 0.68±0.04、7d 0.69±0.05;用药组中各缺血时间点Mfn2蛋白表达水平分别是:1d 1.64±0.13、3d 0.91±0.09、7d 0.82±0.07。在相同时间点,模型组Drpl蛋白表达明显升高,与模型组比较,用药组Drpl蛋白表达量下调降低(P<0.05),与对照组比较,用药组Drpl蛋白表达量上调升高(P<0.05)。在同一处理组,对照组Drp1蛋白随着时间变化表达量未见明显变化,差异不具有统计学意义(P>0.05),在模型组和用药组1d,3d,7d Drp1蛋白的表达呈递增的趋势,于第7天蛋白表达量最多(P<0.05)。在相同时间点,模型组Mfn2蛋白表达明显降低,与模型组比较,用药组Mfn2蛋白表达量上调升高(P<0.05),与对照组比较,用药组Mfn2蛋白表达量下调降低(P<0.05)。在同一处理组,对照组随着时间变化Mfn2蛋白表达未见明显差异(P>0.05),在模型组和用药组1d,3d,7d Drp1蛋白的表达呈递减的趋势,于第7天达最低值(P<0.05)。故在不同的处理组及不同时间点Drp1、Mfn2蛋白表达有差异(P<0.05)。4.qRT-PCR法测定大鼠缺血大脑皮层细胞Drp1及Mfn2mRNA的表达情况:对照组中1d、3d、7d各时间点Drp1mRNA表达水平分别是:0.72±0.02、0.68±0.04、0.69±0.05,模型组中1d、3d、7d各时间点Drp1mRNA表达水平分别是:1.43±0.09、1.59±0.10、2.01±0.05;用药组中1d、3d、7d各时间点Drp1mRNA表达水平分别是:1.23±0.08,1.38±0.09,1.64±0.07。对照组中1d、3d、7d各时间点Mfn2mRNA表达水平分别是:1.02±0.04、0.98±0.06、0.96±0.08;模型组中1d、3d、7d各时间点Mfn2mRNA表达水平分别是:2.06±0.13、1.75±0.07、1.57±0.08;用药组中1d、3d、7d各时间点Mfn2mRNA表达水平分别是:1.76±0.09,1.56±0.10,1.35±0.07。在相同时间点,模型组DrplmRNA表达较对照组明显升高,用药组DrplmRNA表达量在模型组和对照组之间(P<0.05),相较于对照组,用药组的DrplmRNA表达量上调(P<0.05)。在同一处理组,对照组随着时间变化Drp1mRNA表达量未见明显变化,差异不具有统计学意义,模型组和用药组在1天,3天,7天时Drp1mRNA的表达呈递增的趋势,于第7天表达量最多(P<0.05)。在相同时间点,模型组Mfn2mRNA表达明显降低,与模型组比较,用药组Mfn2mRNA表达量上调升高(P<0.05),与对照组比较,用药组Mfn2mRNA表达量下调降低(P<0.05)。在同一处理组,在1天,3天,7天时Mfn2mRNA的表达呈递减的趋势,于第7天达最低值(P<0.05)。故在不同的处理组及不同时间点Drp1、Mfn2蛋白表达量有差异(P<0.05)。结论:1.大鼠脑脑组织缺血后,线粒体功能受损且Drp1及Mfn2蛋白动态平衡被打破从而加重了脑损伤。2.依达拉奉对大鼠早期脑梗死具有保护性作用,机制可能与依达拉奉抵抗线粒体破坏,维持线粒体功能,较少细胞凋亡,使Drp1表达增多,Mfn2表达减少有关。