研究背景和目的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是消化系统中最常见的恶性肿瘤之一。根据最新的流行病学统计调查显示,HCC的发病率在所有恶性肿瘤中位列第6位,死亡率位列第3位,每年新发病例数近80万,其中超过50%的患者发生于我国。肝癌在早期阶段通常没有明显临床症状,一经确诊即属中晚期,约2/3的患者丧失了根治性治疗的时机。另有1/3的患者虽可行手术切除或肝移植治疗,但术后5年复发率却高达75%。对于无法手术的中晚期肝癌患者,经导管动脉化疗栓塞术(transcatheter arterial chemoem-bolization,TACE)、FOLFOX方案(铂类药物为基础)化疗以及索拉非尼(sorafenib)靶向治疗已成为目前最主要的一线治疗手段。不幸的是,仅有少部分患者因此获益,多数患者非但疗效欠佳,甚至出现严重的并发症及毒副反应。其中,耐药是影响肝癌总体预后的重要原因。据有关数据统计,标准方案化疗耐药已至50%,索拉非尼耐药超过70%,而耐药相关死亡率更是高达90%。故此,深刻反思肝癌常规治疗的弊端,重新审视肝癌的发病及耐药机制并拓展肝癌的研究思路,现已变得刻不容缓。诸多研究业已证实,肿瘤组织中存在一小部分具有自我更新、无限增殖和多向分化功能的细胞,这类细胞被定义为肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)或肿瘤起始细胞(tumor-initiating cells,TICs)。肿瘤干细胞最初是在造血系统肿瘤中被发现,随后在很多实体肿瘤组织中也相继证实。学界普遍认为,肿瘤干细胞参与了肿瘤的发生、增殖、分化、复发、转移及耐药等多个生物学进程,并且在这些过程中扮演着“决定性”的角色。反思传统的治疗方法,其仅仅只是杀伤了大量快速增殖的肝癌细胞,并没有杀死这些起“根源性”作用的CSCs,正所谓“斩草不除根”!肿瘤干细胞理论的提出,逐渐改变了我们对于传统肿瘤治疗的观念,为肿瘤病原学研究提供了独特视角。同时另有研究发现,与其他实体肿瘤一样,在肝癌组织中也存在着这样一小群具有自我更新和多向分化潜能的细胞,被称作为肝癌干细胞(liver cancer stem cells,LCSCs)。LCSCs不仅参与肝癌的发生、发展,而且在转移、复发及耐药中发挥着极其重要的作用。从LCSCs的分子生物学层面,深入剖析肝癌的发生及耐药机理,并探寻具有临床转化价值的潜在靶标分子或标志物,对于肝癌的精准诊治具有重要的基础研究意义。微小RNA(microRNA,miRNA)是生物体内长度约为19-25个核苷酸的非编码小分子RNA。miRNA主要通过碱基互补配对的方式与靶基因mRNA的3’端-非翻译区(3’-untranslated region,3’-UTR)结合以调控靶基因的翻译。目前在人类基因组中发现的miRNA大约有2600条,调控了将近60%蛋白基因的表达与翻译。绝大多数miRNA的形成过程是从基因转录开始,经由初级miRNA(primary miRNA,pri-miRNA)的加工、转运与剪切,直至miRNA成熟而最终产生。miRNA的表达异常可影响细胞增殖、凋亡、周期调控、分化、血管生成、自噬、细胞侵袭和迁移等多个细胞生物学表型,甚至导致肿瘤的发生。miRNA在不同类型肿瘤组织中的表达水平存在差异,并且发挥着原癌基因或抑癌基因的作用。已有研究报道,miR-93在胶质瘤中表达降低可抑制肿瘤细胞的生长和转移,而miR-93高表达则能促进乳腺癌细胞的增殖与侵袭。不仅于此,在包括肝癌、食管癌、胃癌、胰腺癌及结直肠癌等多种消化道肿瘤组织或细胞中发现miR-93的异常表达,由此介导调控肿瘤的发生、增殖、侵袭、转移及耐药等多种生物学性状。然而,miR-93在LCSCs中的表达、调控及其作用机制如何?miR-93能否诱导肝癌对顺铂、索拉非尼耐药及其相关机制如何?miR-93在肝癌组织中的表达水平与临床预后的相关性如何?上述问题至今仍未有学者给予明确解答。本论文将通过两部分研究对以上问题进行阐释。第一部分:miR-93靶向结合MTMR3调控肝癌干细胞自我更新与致瘤能力的作用及其机制。从原代肝癌细胞和多种肝癌细胞系中分选、富集得到LCSCs,通过miRNA定量检测发现,miR-93在LCSCs中呈现高表达;构建miR-93低表达和高表达的肝癌细胞系,经由相关实验证实,miR-93具有调控LCSCs自我更新与致瘤能力的功能;利用生物信息学分析方法与分子生物学实验验证得知,MTMR3是miR-93的靶基因。经由基因干扰等实验进一步加以证实,miR-93通过靶向结合MTMR3调控LCSCs的自我更新与致瘤能力。第二部分:miR-93诱导肝癌耐药的相关机制及其临床预后分析。构建动物耐药模型,通过miRNA定量检测发现,miR-93在顺铂或索拉非尼耐药的肝癌组织中呈现高表达;建立miR-93低表达和高表达的肝癌细胞系,通过相关实验证实,miR-93能够诱导肝癌细胞对顺铂或索拉非尼的药物耐受性;临床队列研究揭示,肝癌术后经TACE或索拉非尼治疗,肿瘤组织中miR-93的表达水平与患者的生存预后相关。期望通过本项研究进一步丰富肝癌干细胞的理论基础,为肝癌耐药提供新的潜在靶标及应对策略。研究方法1.收集新鲜肝癌组织标本,分离原代肝癌细胞,利用流式细胞技术分选出CD133+原代肝癌细胞和Ep CAM+原代肝癌细胞。2.收集新鲜肝癌组织标本,通过低粘附成球实验,富集原代肝癌细胞系中的成球肝癌细胞。3.纳入HCCLM3和CSQT-2细胞系,利用流式细胞技术分选出CD133+肝癌细胞和Ep CAM+肝癌细胞。4.纳入HCCLM3和CSQT-2细胞系,通过低粘附成球实验,富集HCCLM3和CSQT-2细胞系中的成球肝癌细胞。5.利用Real-time PCR检测miR-93在LCSCs中的表达量。6.构建miR-93高表达和低表达的慢病毒,通过感染肝癌细胞建立稳定的miR-93高表达和低表达的肝癌细胞系。7.利用Real-time PCR检测miR-93高表达和低表达肝癌细胞系以及正常对照肝癌细胞系中Ep CAM、CD133、CD90、CD24、SOX2、OCT4、c-Myc以及Nanog的表达量。8.利用悬浮成球培养法检测肝癌细胞系的成球数量。9.通过体外有限稀释实验检测miR-93高表达和低表达肝癌细胞系以及正常对照肝癌细胞系中LCSCs比例。10.通过体内有限稀释实验检测小鼠成瘤率。11.通过生物信息学方法预测miR-93的下游靶基因。构建MTMR3野生型及突变型的报告质粒,转染到低表达的肝癌细胞系以及正常对照肝癌细胞系,利用荧光素酶活性报告基因检测进行验证。12.采集新鲜肝癌组织标本,Real-time PCR检测miR-93、MTMR3的表达量并分析两者间的相关性。13.利用流式细胞技术分选出CD133+LCSCs和Ep CAM+LCSCs,低粘附成球培养富集LCSCs,通过Real-time PCR检测MTMR3在LCSCs中的表达量。14.构建si MTMR3、si NC转染的miR-93低表达肝癌细胞系以及正常对照肝癌细胞系,利用Western blot、悬浮成球培养法、体内外有限稀释实验检测MTMR3的蛋白表达情况、肝癌细胞系的成球数量、LCSCs比例以及小鼠成瘤率。15.利用Real-time PCR检测miR-93在顺铂或索拉非尼耐药的肝癌组织中的表达量。16.利用Real-time PCR检测顺铂或索拉非尼处理后肝癌细胞系中miR-93的表达量。17.构建miR-93高表达和低表达肝癌细胞系模型,利用流式细胞技术、Western blot检测顺铂或索拉非尼处理后肝癌细胞系的细胞凋亡率及凋亡蛋白Cleaved-PARP的表达情况。18.采集肝癌术后行TACE治疗的患者肿瘤组织标本及临床资料,Real-time PCR检测组织中miR-93的表达量,通过队列研究分析miR-93的表达水平与生存预后的相关性。19.采集肝癌术后行索拉非尼治疗的患者肿瘤组织标本及临床资料,Real-time PCR检测组织中miR-93的表达量,通过队列研究分析miR-93的表达水平与生存预后的相关性。研究结果第一部分研究结果:(1)CD133+或Ep CAM+肝癌细胞较CD133-或Ep CAM-肝癌细胞miR-93的表达量升高,成球肝癌细胞较贴壁肝癌细胞miR-93的表达量升高,miR-93在LCSCs中高表达;(2)HCCLM3 miR-93 sponge、CSQT-2 miR-93 sponge细胞系均较正常对照肝癌细胞系的成球细胞数量下降,miR-93低表达抑制LCSCs的自我更新能力;(3)HCCLM3 miR-93 sponge、CSQT-2 miR-93 sponge细胞系中Ep CAM、CD133、CD90、CD24、SOX2、OCT4、c-Myc和Nanog的表达量均低于正常对照肝癌细胞系,miR-93与LCSCs表型分子的表达间呈正相关;(4)HCCLM3 miR-93 sponge、CSQT-2 miR-93 sponge细胞系中LCSCs的比例均较正常对照肝癌细胞系下降,下调miR-93表达可降低肝癌细胞系中LCSCs的含量;(5)HCCLM3 miR-93 sponge细胞系较正常对照肝癌细胞系的小鼠成瘤率降低,下调miR-93表达可抑制LCSCs的致瘤能力;(6)HCCLM3 miR-93 mimic、CSQT-2 miR-93 mimic细胞系较正常对照肝癌细胞系的成球数量均升高,miR-93高表达促进LCSCs的自我更新能力;(7)HCCLM3miR-93 mimic、CSQT-2 miR-93 mimic细胞系中Ep CAM、CD133、CD90、CD24、SOX2、OCT4、c-Myc和Nanog的表达量均高于正常对照肝癌细胞系,miR-93与LCSCs表型分子的表达间呈正相关;(8)HCCLM3 miR-93 mimic、CSQT-2 miR-93 mimic细胞系中LCSCs的比例较正常对照肝癌细胞系均升高,上调miR-93表达可增加肝癌细胞系中LCSCs的含量;(9)HCCLM3 miR-93 mimic细胞系较正常对照肝癌细胞系的小鼠成瘤率升高,上调miR-93表达可促进LCSCs的致瘤能力;(10)含野生型MTMR33’-UTR的HCCLM3 miR-93 sponge和CSQT-2 miR-93 sponge细胞系的荧光素酶活性均高于正常对照肝癌细胞系,MTMR3为miR-93的靶向结合基因;(11)CD133+或Ep CAM+HCCLM3、CSQT-2细胞相较于CD133-或Ep CAM-对照肝癌细胞的MTMR3表达量均降低,HCCLM3、CSQT-2细胞系中成球细胞较贴壁细胞的MTMR3表达量均下降,MTMR3在LCSCs中低表达;(12)肝癌组织中的miR-93与MTMR3表达量呈负相关;(13)HCCLM3 miR-93 sponge、CSQT-2 miR-93 sponge细胞系中成球细胞MTMR3的mRNA、蛋白表达均高于正常对照肝癌细胞系,LCSCs中的miR-93与MTMR3表达呈负相关;(14)si NC转染后,HCCLM3 miR-93 sponge、CSQT-2 miR-93 sponge细胞系的成球细胞数量均低于正常对照肝癌细胞系。si MTMR3转染后,两种肝癌细胞系的成球细胞数量均增多至正常对照肝癌细胞系相当水平。下调MTMR3表达可促进肝癌细胞系自我更新能力的提高;(15)si NC转染后,HCCLM3 miR-93sponge、CSQT-2 miR-93 sponge细胞系中LCSCs比例均低于正常对照肝癌细胞系。si MTMR3转染后,两种肝癌细胞系中LCSCs比例均提升至正常对照肝癌细胞系相当水平。下调MTMR3表达可促进LCSCs的含量增加;(16)干扰MTMR3表达可消除miR-93 sponge细胞系与正常对照肝癌细胞系的成瘤差异。第二部分研究结果:(1)顺铂耐受组的miR-93表达量较药物敏感组升高,miR-93在顺铂耐药的肝癌组织中高表达;(2)HCCLM3、CSQT-2、Hep G2、Hep3B和Huh7肝癌细胞系经顺铂处理后,miR-93表达量较vehicle对照组均上升,顺铂可诱导肝癌细胞miR-93高表达;(3)顺铂处理的HCCLM3 miR-93 mimic、CSQT-2 miR-93 mimic细胞系均较正常对照肝癌细胞系的细胞凋亡率下降,miR-93高表达的肝癌细胞系对顺铂耐受性增强;(4)顺铂处理的HCCLM3 miR-93 sponge、CSQT-2 miR-93 sponge细胞系相较于正常对照肝癌细胞系的细胞凋亡率、Cleaved-PARP表达均上升,miR-93低表达的肝癌细胞系对顺铂敏感性增强;(5)索拉非尼耐受组的miR-93表达量较药物敏感组升高,miR-93在索拉非尼耐药的肝癌组织中高表达;(6)HCCLM3、CSQT-2、Hep G2、Hep3B和Huh7肝癌细胞系经索拉非尼处理后,miR-93表达量较vehicle对照组均上升,索拉非尼可诱导肝癌细胞miR-93高表达;(7)索拉非尼处理的HCCLM3 miR-93 mimic、CSQT-2 miR-93 mimic细胞系均较正常对照肝癌细胞系的细胞凋亡率下降,miR-93高表达的肝癌细胞系对索拉非尼耐受性增强;(8)索拉非尼处理的HCCLM3 miR-93 sponge、CSQT-2 miR-93 sponge细胞系相较于正常对照肝癌细胞系的细胞凋亡率、Cleaved-PARP表达均上升,miR-93低表达的肝癌细胞系对索拉非尼敏感性增强;(9)经TACE治疗后,miR-93低表达的肝癌患者较高表达肝癌患者具有更好的生存预后;(10)经索拉非尼治疗后,miR-93低表达的肝癌患者较高表达肝癌患者的生存预后更佳。结论miR-93在肝癌干细胞中呈现高表达,其具有调控LCSCs自我更新与致瘤能力的功能。MTMR3是miR-93的下游靶基因,miR-93通过靶向结合MTMR3调控LCSCs的自我更新与致瘤能力;miR-93在顺铂或索拉非尼耐药的肝癌组织中呈现高表达,其能够调控肝癌细胞对顺铂或索拉非尼的药物耐受性。肝癌术后经TACE或索拉非尼治疗,肿瘤组织中miR-93的表达水平与患者的生存预后密切相关。据报道,自噬参与调节肝癌细胞对顺铂、索拉非尼的耐受性,而MTMR3为自噬启动的关键分子。因此,后续我们将进一步探讨miR-93能否通过调节MTMR3而改变自噬,进而影响肝癌对顺铂、索拉非尼的耐药。本课题的研究丰富了肝癌干细胞的理论依据,为肝癌耐药提供了潜在的预测分子及应对策略,对于改善肝癌的诊疗现状具有重要意义。