基于线粒体融合与分裂研究中医扶正与祛邪疗法诱导人急性髓系白血病KG-1a细胞凋亡的作用机制

来源 :山东中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:dd2010875
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目的:本研究选取益气养阴方及其拆方干预人急性髓系白血病(AML)KG-1a细胞中6种线粒体融合与分裂蛋白表达,探讨中医扶正与祛邪疗法通过线粒体途径诱导白血病细胞凋亡的作用机制,为靶向治疗急性白血病提供理论依据,并为提高白血病的临床疗效提供新的思路和方法。方法:1.培养AML KG-1a细胞作为模型。2.CCK-8法检测不同浓度、不同时间益气养阴方对KG-1a细胞体外生长的抑制作用,由此确定益气养阴方的IC50值和最佳干预时间。3.Annexin V/PI双染法流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡情况,计算细胞凋亡率;PI单染法FCM检测细胞周期分布情况。4.透射电镜观察细胞超微结构与线粒体形态学变化。5.Western blot法检测各组Mfn-1、Mfn-2、Opa-1、Drp-1、Fis-1、Mff的蛋白表达水平。6.RT-qPCR法检测各组Mfn-1、Mfn-2、Opa-1、Drp-1、Fis-1、Mff的mRNA表达水平。结果:1.CCK-8法示益气养阴方可抑制KG-1a细胞增殖(P<0.05),并且具有良好的时间浓度依赖效应。根据所获IC50值,本研究选取益气养阴方浓度为80μmol/L,干预时间为48 h。2.加药作用48 h后,经FCM检测,全方组与祛邪组细胞凋亡率及G1期的阻滞率明显高于对照组和扶正组,且呈剂量依赖性,差异具有统计学意义(p<0.01)。3.电镜结果提示全方组和祛邪组线粒体结构损坏较为严重,而扶正组和对照组线粒体结构则基本完好。4.应用Western-blot法结果显示:与对照组和扶正组相比,全方组和祛邪组Mfn-1、Mfn-2、Opa-1蛋白表达水平均显著降低,同时Drp-1、Fis-1、Mff的蛋白表达水平均显著升高,差异有统计学意义(p<0.01)。全方组与祛邪组之间、扶正组与对照组之间比较,差异无统计学意义(p>0.05)。5.应用RT-qPCR检测Mfn-1、Mfn-2、Opa-1、Drp-1、Fis-1、Mff蛋白的mRNA表达水平,结果显示:与对照组和扶正组相比,全方组和祛邪组Mfn-1、Mfn-2、Opa-1的mRNA表达水平均显著降低,同时Drp-1、Fis-1、Mff的的mRNA表达水平均显著升高,差异有统计学意义(p<0.01)。全方组与祛邪组比较,Mfn-1、Drp-1的mRNA表达水平存在显著差异(p<0.01),Opa-1、Fis-1的mRNA表达水平有差异(p<0.05),Mfn-2、Mff的mRNA表达水平无差异(P>0.05)。扶正组与对照组比较,Mfn-2、Opa-1、Drp-1、Fis-1、Mff的mRNA表达水平存在显著差异(p<0.01),Mfn-1的mRNA表达水平有差异(p<0.05)。结论:1.白血病的发生发展可能与线粒体融合与分裂蛋白Mfn-1、Mfn-2、Opa-1、Drp-1、Fis-1、Mff的异常表达有关。2.KG-1a细胞中线粒体融合蛋白Mfn-1、Mfn-2、Opa-1高表达,线粒体分裂蛋白Drp-1、Fis-1、Mff蛋白低表达,这可能是KG-1a细胞恶性增殖的机制之一。3.益气养阴方可能靶向调控线粒体融合蛋白Mfn-1、Mfn-2、Opa-1表达下调与线粒体分裂蛋白Drp-1、Fis-1、Mff表达上调,即通过干预线粒体融合与分裂以改变线粒体结构和功能,从而诱导急性髓系白血病KG-1a细胞凋亡。4.在本研究中可知,全方组与祛邪组比起扶正组和对照组有显著差异,但全方组和祛邪组比较并无显著差异,而扶正组与对照组比较亦无显著差异,祛邪组比扶正组诱导KG-1a细胞凋亡和干预线粒体融合与分裂蛋白表达的效果更加显著,其原因可能是在体外实验中,缺乏可供扶正药物发挥调节免疫、抗氧化、改善机体内环境等作用的靶点,因此细胞毒作用相对较强的祛邪药物表现出更好的效果。
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