论文部分内容阅读
在神经系统的发育过程中,未成熟神经元的轴突需要不断延展伸长,直至其突起的末端与靶细胞或器官形成突触连接。而在成体神经元轴突受损后,损伤远侧段轴突将退变崩解,在条件合适的情况下近侧端的轴突将发生轴突再生,这个过程与发育阶段的轴突延伸具有一定的相似性。不管是发育中突起的生长还是损伤后轴突的再生,都需要胞体大量转录并合成轴突出芽所需的蛋白质。转录因子是一种DNA结合蛋白,能够与基因上特异性的位点相结合从而直接或间接地调控基因转录。近年来有研究表明通过干预在神经发育过程中发挥重要作用的部分转录因子的表达可以让发育成熟的神经元重返“年轻”的生长状态,从而促进成熟神经元轴突损伤后的再生。神经源性分化因子(Neurogenic differentiation 1,NeuroD1)是神经系统发育过程具有重要作用的一种转录因子。在神经系统发育过程中NeuroD1高表达于神经元,但其表达水平随着发育成熟而降低。研究表明NeuroD1可促进神经元的发育与分化,同时在突起延长过程发挥重要的调控作用。但是,迄今为止尚无证据显示NeuroD1能否对受损成熟神经元的轴突再生发挥作用。这正是本课题拟回答的关键科学问题。鉴于以往研究提示NeuroD1可以通过调控神经营养因子受体的表达从而影响神经元发育,也可以通过调控细胞骨架重排来影响神经分化和神经元迁移。故本课题还从这两方面对NeuroD1影响轴突再生的机制进行了初步探讨。研究方法1.利用腺相关病毒pAAV-Flex-CAG-ND1-P2A-mCherry 和rAAV-hSYN1-Cre-WPE-pA(以下简称AAV-NeuroD1)作为载体在成体小鼠脊髓腰膨大局部微量注射方法使得运动神经元过表达NeuroD1。对照组采用同 样 的 方 法 微 量注 射 pAAV-Flex-CAG-P2A-mCherry 和rAAV-hSYN1-Cre-WPE-pA(以下简称AAV-con)。病毒注射7d或21天后通过Western blot和免疫荧光等方法检测NeuroD1的表达。2.利用脊髓腰膨大运动神经元成功转染病毒的小鼠制备坐骨神经夹伤模型,术后3d取材,通过免疫荧光和Western blot检测GAP43在损伤远侧神经的表达情况,以此来评价AAV-NeuroD1转染组(以下简称NeuroD1组)和AAV-con转染组(以下简称con组)轴突再生速度的区别。另有一批动物在术后存活14d,然后进行行为学和神经电生理检测观察神经损伤后后肢运动功能和神经传导功能的恢复情况。最后取材称重检测腓肠肌湿重比,以及采用组织学方法(HE染色、BTX染色复合NF200免疫荧光)检测腓肠肌横截面积和运动终板支配率等靶区肌组织修复情况进行对比分析。3.在体外培养的PC12细胞中利用逆转录病毒载体(RV-NeuroD1或RV-con)进行转染并利用免疫荧光和Western blot检测NeuroD1蛋白表达。将转染后的PC12细胞诱导分化为神经元,再参照文献报道的方法构建神经元轴突损伤体外细胞模型。在此细胞模型上,通过q-PCR和Western blot初步筛选出NeuroD1过表达对神经营养因子BDNF及其受体TrkB,以及微管切割蛋白Spastin的表达有显著影响。4.利用AAV-NeuroD1或AAV-con转染后的小鼠制备坐骨神经夹伤模型,术后3d取材,通过免疫荧光法和Western blot检测脊髓前角运动神经元中BDNF、TrkB以及Spastin表达情况。研究结果1.NeuroD1过表达可以促进小鼠坐骨神经损伤后结构与功能修复。1.1 hSYN1-Cre介导的AAV-NeuroD1病毒载体可以在脊髓内特异性转染神经元,免疫荧光和Western blot均显示成年脊髓神经元以及AAV-con转染的神经元并不表达NeuroD1蛋白,而NeuroD1组在微量注射7d或21d后脊髓神经元均能稳定过表达NeuroD1蛋白。1.2 坐骨神经夹伤3d后在损伤远侧神经内GAP43阳性再生轴突的长度(神经纵切片测量从损伤点至GAP43阳性再生轴突最远端距离)和GAP43阳性再生轴突的数量(在距离神经损伤点远侧3-4mm的横切片测量GAP43 阳性轴突数)均显示NeuroD1组显著性大于对照组。Western blot结果也显示在损伤远端神经内GAP43总蛋白表达水平是NeuroD1组显著性大于对照组。1.3 腓肠肌湿重比(损伤侧与正常侧的比值)、肌纤维横截面积、a-BTX 阳性运动终板数量以及NF阳性轴突支配的运动终板比率等统计结果均显示为NeuroD1组显著性大于对照组。1.4 行为学检测显示术后14d两组动物后肢均有一定的功能恢复,其中NeuroD1组表现更加明显。CatWalk步态分析得出的SFI值也是NeuroD1组显著性大于对照组。1.5 CMAP神经电生理检测结果显示NeuroD1组波幅更大,与对照组之间差异具有统计学意义。2.NeuroD1促进轴突再生的机制探究2.1 免疫荧光染色显示PC12细胞经诱导后可以分化为DCX和TuJ1阳性的神经元,而未诱导的PC12细胞则阴性。2.2 利用逆转录病毒转染PC12细胞,免疫荧光和Western Blot结果显示RV-NeuroD1转染细胞的NeuroD1表达水平显著提高。2.3 PC12诱导分化后的神经元损伤后重铺板可以重新长出突起,其中RV-NeuroD1转染神经元的再生突起长度显著大于同培养皿中的未转染细胞以及RV-Con转染神经元。2.4 q-PCR结果显示TrkB、Spastin和p80-Katanin表达在NeuroD1转染后的损伤神经元中mRNA表达水平显著增加,而TrkA、TrkC、P75和p60-Katanin等无明显变化。Western Blot检测证实NeuroD1过表达提高了 TrkB和Spastin的蛋白表达水平。2.5 脊髓组织的免疫荧光染色结果显示过表达NeuroD1的前角运动神经元中BDNF及其受体TrkB以及Spastin的表达水平均显著大于邻近的未转染神经元以及AAV-con转染组的神经元。Western blot显示脊髓腰膨大中TrkB、BDNF和Spastin的总蛋白水平也是NeuroD1组显著性大于对照组。研究结论本研究利用病毒载体特异性转染脊髓神经元并使其稳定过表达NeuroD1,使用坐骨神经夹伤模型作周围神经损伤,从形态学、行为学和电生理等方面探究了 NeuroD 1对周围神经再生的影响,证实了运动神经元过表达NeuroD 1可促进其轴突在损伤后的再生能力。经体内外实验研究初步探明其作用机制可能是与神经营养因子BDNF及其受体TrkB和微管切割蛋白Spastin的表达有关。