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目的:EGFR-TKIs耐药引起肿瘤进展是当前NSCLC治疗的主要重点和难点,siRNA可沉默耐药相关基因表达但缺乏靶向性。为提高siRNA的靶向性,本研究设计并优化EGFR靶向单链抗体核苷酸序列,在大肠杆菌中表达后,纯化人源性抗EGFR单链抗体(scFv,s-9R)融合蛋白,并对纯化产物的抗原结合活性、细胞内化活性及核算携带能力进行鉴定;研究s-9R携带siRNA在体内、外的抗肿瘤活性。方法:1.根据人源性抗EGFR抗体轻、重链可变区氨基酸序列,设计、合成其单链抗体核酸表达序列,将轻链与重链核酸序列通过G4S连接肽相连并在核酸序列末端加入九聚精氨酸及His.tag表达序列,以构建scFv及s-9R融合基因。将测序正确的融合基因连接入原核表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达后行亲和层析纯化并酶切GST.tag。表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,ELISA分析融合蛋白的抗原结合活性,凝胶迁移阻滞实验检测s-9R与核酸的结合活性,间接免疫荧光和流式细胞术检测检测融合蛋白的内化活性。2.scfv及s-9r与egfr-sirna,met-sirna,kras-sirna及her2-sirna分别混合后,加入h1975,h1993,a549,spc-a1,pc-9及h69细胞培养液中共孵育,同时加入/不加入gefitinib。通过rt-qpcr,westernblot实验分析基因表达水平;通过mtt实验、流式细胞学实验、平板克隆实验分析egfr-tkis细胞药物敏感性。3.使用近红外染料dylight800nhsester对单链抗体融合蛋白进行标记,经鼠尾静脉对h1975细胞荷瘤裸鼠注射标记后的融合蛋白,活体成像观察融合蛋白在肿瘤部位富集及全身代谢过程。使用cy5荧光染料标记sirna,经h1975细胞荷瘤裸鼠鼠尾静脉注射融合蛋白/cy5-sirna,活体成像观察融合蛋白/cy5-sirna在肿瘤部位富集及全身代谢过程。经鼠尾静脉注射融合蛋白/egfr-sirna混合物,并同时gefitinib灌胃,观察裸鼠荷瘤变化;经鼠尾静脉注射融合蛋白/her2-sirna混合物,观察裸鼠荷瘤变化。剥离荷瘤组织后对组织切片进行免疫组化实验,观察egfr、her2、ki67表达情况;对组织切片进行tunel标记,观察细胞凋亡情况。结果:1.pgex-4t-1-scfv及pgex-4t-1-s-9r质粒转化大肠杆菌bl21(de3)后,iptg诱导表达融合蛋白scfv及s-9r,经sds-page及westernblot证实表达成功;elisa分析证实两条单链抗体融合蛋白具有良好的egfr结合活性;凝胶迁移阻滞实验表明s-9r具有核酸结合活性;间接免疫荧光及流式细胞术实验显示两条单链抗体融合蛋白能够特异性结合并内化入egfr阳性的肿瘤细胞中,而不能内化入egfr表达阴性肿瘤细胞中;s-9r可以携带fam-sirna结合并内化入egfr阳性的肿瘤细胞中,而scfv则无此功能。2.s-9r可以携带egfr-sirna,met-sirna,kras-sirna及her2-sirna内化入肿瘤细胞中,并下调细胞中egfr、met、kras、her2基因的表达;联合应用gefitinib后h1975、h1993及a549细胞的凋亡水平较对照组明显提高;s-9r/her2-sirna混合物可以使spc-a1,pc-9增殖能力、克隆形成能力降低,细胞周期出现g1期停滞。3.小动物活体成像显示两条单链抗体融合蛋白本身能够通过循环系统富集于裸鼠荷瘤部位,其中s-9r可以携带cy5/fam荧光素标记的sirna富集于裸鼠荷瘤部位,并内化入瘤细胞中;经鼠尾静脉注射s-9r/egfr-sirna混合物联合gefitinib灌胃,或单独经鼠尾静脉注射s-9R/HER2-siRNA混合物可以使裸鼠荷瘤生长受到明显抑制,病理切片显示肿瘤细胞靶蛋白表达减少,增殖能力下降,凋亡细胞增多,荷瘤血管形成能力降低。实验组裸鼠生存时间延长,移植瘤成瘤率下降,荷瘤体积变小、重量减轻。结论:所设计、构建的EGFR靶向单链抗体scFv及s-9R可以在体内、外特异性的识别结合EGFR表达阳性NSCLC细胞。s-9R可以携带特异性siRNA内化入肿瘤细胞之中抑制靶蛋白表达,发挥siRNA的生物学作用,具有恢复Gefitinib敏感性,抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞凋亡的作用。我们的研究为解决当前NSCLC临床治疗中所面对的酪氨酸激酶抑制剂耐药问题,以及治疗以HER2为驱动基因的NSCLC,提供了一条新的方法和思路。