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研究背景及目的:急性胰腺炎(Acute pancreatitis,AP)是胰酶激活引起的胰腺局部炎性,分为轻、中、重度,其中重度AP也称重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)。SAP由初期的局部炎症,发展为大量炎性介质释放到循环系统,导致多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS)和全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome,SIRS)。在SIRS和MODS期间,全身大量炎症介质的释放可能导致肠道屏障功能障碍,并导致肠道内大量致病菌和内毒素(Endotoxin,ET)的移位,导致脓毒症,加重SIRS和MODS。同时,肝脏是SAP继发多脏器损伤中最早且最容易发生的器官,伴发肝损伤的概率高达88.9%。全身大量炎症介质的释放是造成肝脏损害的主要因素,其次肝对ET的清除、肠源性感染的二次打击等均能导致肝功能的损伤,主要表现为谷草转氨酶(Aspartate transaminase,AST)、谷丙转氨酶(Alamine aminotransferase,ALT)和总胆红素(Total bilirubin,TBil)的升高。肝的损伤程度可影响SAP的预后,也是SAP合并MODS患者死亡的主要原因。近年来研究发现,高迁移率族蛋白B1(High mobility group box 1 protein,HMGB1)是作为一种核内非组蛋白在SAP并肝损伤时发挥重要作用。SAP时,HMGB1在炎症介质肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)或ET的主要成分脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)等刺激下由单核/巨噬细胞释放,也可通过各种组织的坏死细胞释放到细胞外。释放到细胞外的HMGB1可与Toll样受体-4(Toll-like receptor Toll,TLR4)受体结合,导致核转录因子-kB(Nuclear factor of kappa B,NF-κB)活化,介导白细胞介素-6(Interleukin,IL-6)和TNF-α等炎性介质基因的表达,形成炎症级联式放大的恶性循环,导致并加重SIRS。酪酸梭菌(C.butytyricum)是肠道内的常见的益生菌,其在肠道内分解肠道内容物产生多种短链脂肪酸。有研究认为,其主要产物丁酸在肠道炎症疾病中可以维持肠屏障的稳定、抑制炎症介质表达、调节肠道微生态和肠道免疫等。本团队通过前期实验证明酪酸梭菌及其产物的丁酸能通过保护肠道屏障功能,减少炎症介质及内毒素通过肠道黏膜进入循环系统,减轻全身炎症反应。但酪酸梭菌能否通过肠粘膜屏障的保护及全身炎症的减轻,维护肝损伤?为此设置本实验,通过酪酸梭菌和丁酸对SAP并肝损伤大鼠模型的预处理,观察其对肝损伤的疗效,并探讨是否通过抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路活化来发挥作用。建模及研究方法:1.动物模型的建立:40只SPF级Sprague-Dawley大鼠,使用随机数表法,分成4组(n=10):正常对照组(Control group,CON组),重症急性胰腺炎并肝损伤组(SAP组),重症急性胰腺炎并肝损伤用酪酸梭菌组治疗(SAP+C.butyricum group,SAP+CB组),重症急性胰腺炎并肝损伤用丁酸钠治疗组(SAP+Sodium butyrate group,SAP+SB组)。4组大鼠分别用生理盐水、生理盐水、酪酸梭菌和丁酸灌胃10天,第11天用4.5%牛磺胆酸逆行注射法建模,CON组以假手术代替。2.取材:建模24h后进行取材,开腹前先做腹腔内及腹水压测定,取大鼠腹主动脉血、胰腺、肝、回肠组织。3.检测指标:查血淀粉酶、脂肪酶含量和胰腺组织病理评分评估胰腺损伤情况;查血AST、ALT、TBil含量和肝组织病理评分评估肝损伤情况;测血LPS含量、回肠组织病理评分和Western Blot检测回肠紧密连接蛋白表达评估肠粘膜损伤情况,测血TNF-α,IL-6评估全身炎症情况。查血HMGB1含量,用免疫组化和Western Blot方法检测HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白在回肠和肝组织表达情况,用RT-qPCR方法检测HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA、NF-κB mRNA表达情况,评估HMGB1/TLR4/NF-κB通路在肠道和肝组织表达表达情况。研究结果:1.SAP组的血淀粉酶、脂肪酶、AST、ALT、TBil含量及胰腺病理评分和肝病理评分较CON组明显增加(P<0.05),胰腺及肝损伤明显,建模成功。经过酪酸梭菌或丁酸钠处理,SAP+CB组和SAP+SB组较SAP组明显减少(P<0.05)。而SAP+CB和SAP+SB组之间无明显差异(P>0.05)。2.SAP组的血LPS含量和小肠病理评分较CON组明显增加,经过酪酸梭菌或丁酸钠处理,SAP+CB组和SAP+SB组较SAP组明显减少(P<0.05)。而SAP+CB和SAP+SB组之间无明显差异(P>0.05)。SAP组紧密连接蛋白(ZO-1,Claudin-1,Occludin)在回肠表达较CON组明显减少(P<0.05)。SAP+CB组和SAP+SB组较SAP组明显升高(P<0.05)。而SAP+CB和SAP+SB组之间无明显差异(P>0.05)。3.SAP组的血TNF-α,IL-6含量较CON组明显增加(P<0.05),经过酪酸梭菌或丁酸钠处理,SAP+CB组和SAP+SB组较SAP组明显减少(P<0.05)。而SAP+CB和SAP+SB组之间无明显差异(P>0.05)。4.SAP组血HMGB1含量,回肠和肝组织中HMGB1,TLR4,NF-κB蛋白及基因的表达明显高于对照组(P<0.05),经过酪酸梭菌或丁酸钠处理,SAP+CB组和SAP+SB组较SAP组明显减少(P<0.05)。而SAP+CB和SAP+SB组之间无明显差异(P>0.05)。研究结论1.SAP并肝损伤时,炎症因子TNF-α和IL-6等大量释放,导致胰腺、肝和肠粘膜等器官有不同程度的受损,益生菌酪酸梭菌及丁酸的干预可在一定程度上抑制炎症介质的释放,保护肠道粘膜,缓解胰腺、肝等器官的损伤。2.SAP并肝损伤时,酪酸梭菌和丁酸在肠道和肝内发挥抗炎作用,可能是通过抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路活化来实现。