松弛素家族是一类小分子的多肽激素,在脊椎动物的研究过程中,我们发现了松弛素家族共有7个家族成员,分别是：RLN1, RLN2, RLN3, INSL3, INSL4, INSL5和INSL6,他们在哺乳动物的许多生理活动中具有重要的作用,例如在妇女妊娠期间能够抑制子宫肌的收缩以有利于妊娠,改善心血管,渗透压的调控以及能够促进生殖组织的生长和发育。松弛素3 (Relaxin3; RLN3)是一种新型的松弛素家族成员,在哺乳动物中,松弛素3参与调控哺乳动物的记忆,食欲,压力应激,认知能力,渗透压,大脑的焦虑等生理活动。在硬骨鱼类尼罗罗非鱼中,我们通过共线性分析和系统进化树分析得到了两种rln3的同源基因rln3a和nrln3b,这两种同源基因的出现是在鱼类特有的一次基因组复制中产生的。但是在硬骨鱼类中,这两种rln3基因的作用机制几乎没有报道,我们对这两种rln3基因的功能所知甚少!尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)是世界上重要的养殖鱼类,其性别决定类型为XX/XY型。由于其容易获得单一性状的鱼苗以及他们的全部基因组已经测序完成并公开,所以尼罗罗非鱼已经成为研究硬骨鱼类性生殖与发育良好的实验模型。本研究我们主要通过RT-PCR和Real-time PCR发现了两种rln3的表达模式：rln3a主要表达在尼罗罗非鱼的精巢而rln3b主要分布于脑中。我们又通过基因敲除方法发现rln3a在尼罗罗非鱼性别方面的功能以及rln3b在尼罗罗非鱼渗透压方面的作用,主要研究结果如下：1)我们从尼罗罗非鱼的成鱼精巢中分离了两种rln3基因：rln3a和rln3b,他们的ORF全长分别为444 bp和456 bp,编码的蛋白质分别为147和151个氨基酸。系统进化树分析显示,硬骨鱼类的rln3基因和四足动物和腔棘鱼形成了不同的进化树分支。然而有趣的是,我们通过共线性发现rln3b,和四足动物的rln3是直系同源基因,因为rln3b的共线性上的基因CC2DL1A and NANOS3和四足动物的共线,而在rln3a上并没有这些基因。2)通过Real-time PCR我们可以发现尼罗罗非鱼的rln3a在精巢,脑,垂体和肾脏中表达,但主要表达在精巢。Rln3b在脑和其他地方,例如垂体和精巢中表达,但是在脑中的表达量最高。通过Real-time方法,我们发现在性腺中rln3a只表达在尼罗罗非鱼的精巢中,在卵巢中基本不表达,而且是各个时期表达量都很低,基本都保持在本底水平。Rln3a在精巢中的表达量从30天开始升高,在90d进一步升高,到150d达到最高值,之后一直保持在最高水平。而rln3b在精巢中的表达量升高的比较晚,直至150d才开始上升,而它在卵巢中表达量也很低,保持在本底水平。3)利用CRISPR/Cas9靶向基因敲除技术在罗非鱼XY个体成功敲除rln3a基因,组织学观察发现：在3个月和5月龄的rln3a突变个体中,与对照组相比,精母细胞和精子生成受阻。特别是在90天的阳性突变rln3a鱼中,精原细胞的增殖受阻,基本观察不到精原细胞的生成。一直持续到150天,精原细胞的增殖和精子的生成慢慢恢复,但是恢复不完全。在240天检测突变阳性鱼,才基本恢复。免疫组织化学染色发现：在90天时候,rln3a突变鱼与正常对照组相比,精原细胞的标记基因’Vasa基因和Eflalb基因都检测不到,说明突变组基本没有精原细胞的生成,这与我们组织学观察到的结果一致。直到150天,rln3a突变组的精原细胞开始慢慢出现,精子生成也开始慢慢恢复,在部分突变鱼的精巢中可以检测到’Vasa和Eflalb基因的表达,而在部分突变鱼精巢中仍然检测不到Vasa和Ef1a1b基因的表达,也没有观察到精原细胞和精子的生成。而在240天时,rln3a突变鱼的精子发生已经基本恢复,即有精原细胞的生成,又有减数分裂和精子的生成。4)为了检测rln3a和rln3b在尼罗罗非鱼渗透压方面的功能,我们分别用不同盐度和不同时间组处理正常尼罗罗非鱼,然后取其脑组织,提取RNA,做Real-timePCR检测rln3a和rln3b的变化情况,检测结果：rln3b在处理4天后,在8ppt浓度的Nacl中和对照组与20ppt浓度的Nacl表达升高,而在在20ppt浓度的Nacl中的表达量明显高于对照组,并且有显著性差异,而在处理8天后,对照组,8ppt浓度的Nacl组和20ppt浓度的Nacl组,rln3b的表达量逐次升高,且都有明显的差异性,说明rln3b随着Nacl浓度的升高,其表达量也升高。而在处理的8ppt浓度的Nacl组和处理的20ppt浓度的Nacl组,rln3b的表达量都是随着时间的变化逐渐升高,也具有明显的差异性,这说明rln3b随着时间的推移,其表达量也升高,而rln3a不管在哪种条件下其表达量始终不变。综上所述,我们从尼罗罗非鱼中分离鉴定了两种直系同源的rln3基因,分别鉴定了他们的表达和功能。rln3a主要表达在精巢中,我们通过CRISPR/Cas9靶向基因敲除技术发现rln3a在精子发生过程中具有重要作用；而rln3b主要表达在脑中,和渗透压的调节有关。