研究背景肿瘤作为一种衰老性疾病,其发病率会随着年龄的增长而迅速上升。已有研究报道,与年轻肿瘤患者相比,年老的患者肿瘤的转移率更高,总生存率更差,并且对靶向治疗的反应性也更差。免疫系统是哺乳动物中一种有效的保护性生理系统。免疫系统的先天性和适应性免疫应答反应均与年龄相关变化有关,这称为免疫衰老。免疫系统在控制肿瘤进展的方面非常重要,因此老年人的免疫功能障碍可能会损害免疫监测,从而促进年老患者的肿瘤进展。在过去的20年中,虽然肿瘤免疫方面的研究取得了重大进展,但尚未在年轻和年老个体中详细的比较免疫系统对肿瘤进展的调控作用及机制。我们的研究认为,免疫细胞特别是CD8+T细胞的衰老及功能变化,会对肿瘤的进展及患者的预后产生重要的影响。已有一些研究报道认为:T细胞数量随着年龄的增长而下降,主要是由于胸腺退化和萎缩导致T细胞输出的减少。但是这些研究尚未阐明其相关机制。因此,本研究中,我们分析了年轻和年老的个体中CD8+T细胞的变化,以及CD8+T细胞这种年龄相关的变化对肿瘤进展的影响及其可能的调控机制。m6A（N6甲基腺苷:N6-methyladenosine）是一种最普遍的RNA修饰,也是最丰富的转录组修饰之一,它参与转录后及翻译水平的调节。m6A修饰在肿瘤进展中影响很多重要的生物学过程,如免疫异常信号的传导和肿瘤的进展。RNA的m6A修饰可以被一个由METTL3和METTL14组成的核心甲基转移酶复合物沉积,并被去甲基转移酶ALKBH5和FTO等酶去甲基化修饰。作为甲基转移酶复合物的核心催化成分,METTL3在多种肿瘤的发生发展中起原癌基因的作用,可以通过调控其下游靶RNA的m6A水平来影响肿瘤细胞的增殖。m6A阅读蛋白（如YTH家族蛋白等）可以识别发生m6A修饰的RNA,进而影响其剪接,转运,稳定性和翻译过程。总体而言,m6A修饰在基本细胞生物学过程中发挥着复杂的网络调控作用。但是,m6A修饰在细胞衰老尤其是免疫衰老方面中的作用仍然未知。基于以上的思考,本课题主要探讨在年轻和年老个体中肿瘤进展及预后的差异、CD8+T细胞在调控年老个体肿瘤进展中的作用,以及CD8+T细胞中m6A修饰的改变对其功能的影响,利用动物模型、细胞模型和临床标本等分析相关现象及作用机制。第一部分年龄对肿瘤转移及预后的影响目的利用不同肿瘤模型,探讨年轻和年老小鼠中肿瘤进展的变化,以及年龄对临床患者肿瘤进展、转移和预后的影响。方法（1）利用B16F10,4T1及LLC小鼠肿瘤细胞系的皮下移植瘤模型,探讨不同周龄的小鼠模型中肿瘤生长的情况,并通过小动物活体成像系统对比不同周龄小鼠的肿瘤肺转移情况,分析不同年龄荷瘤小鼠的生存。（2）通过建立B16F10,4T1尾静脉和4T1原位成瘤后切除的小鼠肺转移模型,验证年轻和年老小鼠的肺转移情况和生存情况。（3）收集不同肿瘤类型患者的临床资料,随访病人生存,分析年龄对肿瘤进展及其预后的影响。（4）利用TCGA数据库中不同类型肿瘤患者的临床资料,分析年龄对肿瘤转移及其预后的影响。结果（1）通过不同类型的皮下移植瘤小鼠肿瘤模型,发现在年轻的小鼠中,肿瘤增殖相对于年老小鼠增殖快。（2）通过尾静脉和原位成瘤后切除的不同类型肿瘤转移模型,发现相对于年轻的小鼠,年老小鼠更容易发生肿瘤肺转移,且小鼠生存时间短。（3）通过分析随访医院不同类型肿瘤患者的临床资料信息,发现相对于年轻患者,年老肿瘤患者的预后更差。（4）根据TCGA数据库的结果,分析不同类型肿瘤患者的临床信息,发现转移的患者预后更差。并且分析表明年老肿瘤患者的预后更差。结论在不同类型的小鼠肿瘤模型中,年老小鼠的肺转移灶更多,生存更差。不同类型的临床肿瘤患者中,年老患者的预后更差。这表明,年龄是影响肿瘤进展的关键因素,且影响肿瘤患者的转移及预后。第二部分年龄对CD8+T细胞m6A甲基化修饰的影响目的探讨年轻和年老个体CD8+T细胞中m6A修饰水平的差异及对CD8+T细胞功能的调控。方法（1）利用流式细胞术,分析年轻和年老小鼠及肿瘤患者中CD8+T细胞的差异。并且通过TCGA数据库分析CD8+T细胞的浸润与肿瘤患者年龄及预后的相关性。（2）清除小鼠的CD8+T细胞,结合肿瘤转移模型,探讨CD8+T细胞对小鼠肿瘤转移及生存的影响。（3）利用流式细胞术,分析年轻和年老小鼠中CD8+T细胞的衰老状态及功能的差异。（4）通过m6A整体甲基化检测试剂盒,分析年轻和年老小鼠CD8+T细胞的m6A整体甲基化水平。（5）通过对年轻和年老小鼠活化的CD8+T细胞进行MeRIP-Seq和mRNA-Seq联合测序分析,探究年轻和年老小鼠CD8+T细胞中发生m6A甲基化差异并探究影响CD8+T细胞功能的关键通路。结果（1）相对于年轻的小鼠,年老小鼠中CD8+T细胞的比例更低,肿瘤患者年龄与CD8+T细胞的浸润呈负相关的关系。（2）分析TCGA数据库结果发现,CD8+T细胞的浸润水平与肿瘤患者转移及预后呈负相关的关系。（3）清除CD8+T细胞之后,小鼠的肿瘤肺转移数量增加,生存期短。（4）年老小鼠中CD8+T细胞处于衰老的状态,且增殖减慢,功能降低。（5）年老小鼠CD8+T细胞中整体的m6A甲基化水平降低。（6）通过对年轻和年老小鼠的CD8+T细胞进行MeRIP-Seq和mRNA-Seq的测序分析,发现在年老小鼠中CD8+T细胞的m6A修饰水平降低,且通过GO分析发现淋巴细胞增殖和活性的通路富集在m6A修饰下调和mRNA表达下调的基因集。结论年老小鼠中CD8+T细胞处于衰老状态,且功能降低,影响年老小鼠的肿瘤进展及生存。肿瘤患者的年龄影响CD8+T细胞的浸润。清除CD8+T细胞影响肿瘤的进展。年老小鼠CD8+T细胞的整体m6A甲基化水平降低。第三部分METTL3通过介导Syk的表达影响CD8+ T细胞衰老目的探讨METTL3是调控Syk表达的关键m6A甲基转移酶,进而影响CD8+T细胞的功能。方法（1）通过KEGG分析MeRIP-Seq和mRNA-Seq的测序结果,寻找调控CD8+T细胞功能的关键基因。（2）利用RT-PCR等实验方法,检测Syk在年轻和年老小鼠CD8+T细胞中的表达差异。（3）流式细胞术检测Syk抑制剂对CD8+T细胞功能的影响。（4）利用RT-PCR、Western Blotting等实验技术方法,检测年轻和年老小鼠中CD8+T细胞上重要的甲基转移酶和去甲基转移酶的表达差异。并且在年轻和年老小鼠中CD8+T细胞的mRNA-Seq测序结果中进行验证。（5）通过RT-PCR、Western Blotting等实验技术方法分析METTL3对Syk表达的调控,并利用GEPIA数据库在临床患者中验证。（6）利用H2O2诱导的衰老模型,验证METTL3在衰老的CD8+T细胞上的表达情况,并通过RT-PCR、Western Blotting等方法进一步探究H2O2诱导的衰老模型中Syk及下游通路的表达。（7）建立CD8+T细胞上METTL3敲除的小鼠模型,分析METTL3敲除与肿瘤转移及小鼠生存的相关性及对下游靶基因Syk表达的影响。（8）通过筛选METTL3的抑制剂,利用RT-PCR等的实验技术方法进一步分析METTL3与Syk表达的相关性。结果（1）通过对年轻和年老小鼠活化的CD8+T细胞进行MeRIP-Seq和mRNA-Seq的测序分析,发现在年老小鼠CD8+T细胞中Syk的表达和m6A修饰水平均降低。（2）体外实验进一步验证Syk在年老小鼠的CD8+T细胞中的表达降低。（3）加入Syk抑制剂之后,Syk的表达降低,CD8+T细胞的功能降低。（4）甲基转移酶METTL3在年老小鼠的CD8+T细胞中表达降低。METTL3在H2O2诱导的衰老模型中也表达降低。并且在年轻和年老小鼠中CD8+T细胞mRNA-Seq的测序结果中得到进一步的验证。（5）敲除METTL3之后,Syk的表达降低。（6）H2O2诱导的衰老模型中,METTL3和Syk的表达均降低。（7）加人METTL3抑制剂之后,Syk的表达降低。（8）利用流式细胞术检测METTL3通过Syk-PI3K-AKT通路调控CD8+T细胞的功能。结论在年老小鼠的CD8+T细胞中,METTL3的表达较年轻小鼠降低,且其通过下调Syk靶基因,抑制PI3K-AKT通路活化,进而使CD8+T细胞功能的降低,导致年老小鼠肿瘤进展,影响年老小鼠的生存。第四部分CD8+T细胞中Syk通路在年轻和年老肿瘤患者中的临床意义目的探讨CD8+T细胞Syk表达对临床患者肿瘤进展及预后的影响。方法（1）利用TCGA数据库分析在临床肿瘤患者CD8+T细胞上METTL3的表达对患者预后的影响,并且分析METTL3与CD8+T细胞衰老及功能分子表达的相关性。（2）利用免疫组化数据库分析肿瘤患者CD8+T细胞上METTL3和Syk表达的相关性,并且用GEPIA数据库进一步验证METTL3和Syk的共表达对肿瘤患者预后的影响。（3）利用免疫组化数据库分析肿瘤患者的年龄对Syk表达的影响。利用TCGA数据库分析肿瘤患者Syk的表达对患者预后的影响。（4）利用TCGA数据库分析CD8A与Syk表达的相关性,以及分析CD8A与Syk共表达对肿瘤患者预后的影响。（5）利用免疫组化数据库分析肿瘤患者的年龄对CD8A表达的影响。（6）利用TCGA数据库分析肿瘤患者中年龄与CD8A表达的相关性,以及CD8A的表达对肿瘤患者预后的影响。结果（1）CD8+T细胞上低表达METTL3的肿瘤患者的生存较差,并且METTL3表达与CD8+T细胞衰老及功能分子表达相关。（2）METTL3与Syk的表达有显著的相关性,并且METTL3与Syk的共同低表达与肿瘤患者的不良预后相关。（3）在年老肿瘤患者的组织中,Syk的表达低,并且利用GEPIA数据库发现Syk低表达组的肿瘤患者预后较差。（4）CD8A与Syk的表达呈正相关关系,且CD8A与Syk的共同低表达与肿瘤患者的不良预后相关。（5）在年老的肿瘤患者中,CD8A的表达相对低。（6）TCGA数据库分析表明,CD8A的表达与肿瘤患者的年龄呈现负相关关系。并且CD8A的低表达与肿瘤患者的不良预后相关。结论在年老的肿瘤患者中,CD8+T细胞以及METTL3和Syk的表达影响患者的预后。METTL3和Syk可能可以作为治疗肿瘤的关键靶点。