第一部分机械通气相关性肺损伤大鼠肺组织Stiml/Orail蛋白的表达研究背景:随着医疗技术水平的不断提高和人口老龄化的加速,需要接受呼吸机辅助治疗和全身麻醉的病人越来越多,机械通气辅助呼吸为肺损伤患者肺功能恢复正常提供了有力的保障,赢得了宝贵的时间,然而机械通气亦可诱发肺损伤:机械通气相关性肺损伤(VILI),表现为接受呼吸机治疗的患者肺功能无明显的改善或者进行性的加重,严重的进展为急性呼吸窘迫综合征,威胁患者的生命。目前VILI受到重症监护医师和麻醉医生的普遍重视。VILI发生机制包含机械性牵张病变不均一的肺组织,对肺组织产生气压伤,以及肺组织过度扩张,及局部的肺组织不张,以及诱发和加重炎症反应的进展(生物伤)。临床上患者肺气血屏障功障碍,肺组织进行性的渗出性病变,发展为急性肺水肿,血氧饱和度下降,无法维持机体正常的氧供需平衡。寻求肺水肿的发生机制,改善肺气血屏障功能能够有效的预防和治疗VILI。机械通气时,过高的机械张力可以激活内皮细胞膜上的钙离子通道,导致钙离子内流,细胞内钙离子浓度升高导致肺微血管通透性升高。钙库操纵的钙内流是调节钙离子进入细胞最普遍的一种途径,它的通道称为钙库操纵的钙内流通道,基质相互作用分子l(Stiml)和Orail是组成该通道的两种主要蛋白质。Stiml为内质网钙离子感受器,Orail是细胞膜上钙离子通道,Stiml感受细胞内钙离子的变化,通过与Orail蛋白的结合,调节钙离子内流;增加的钙离子能够激活细胞内多条信号通路,细胞内钙依赖的PKCα活化,调节肺微血管内皮细胞的通透性,导致肺血气屏障功能障碍,渗出性增加,加重肺水肿。BTP2为Orail通道阻滞剂,通过与Orail蛋白相结合,阻断钙离子内流,切断后继的信号传导通路,阻止肺水肿的发生。通过建立机械通气诱发的急性肺损伤大鼠动物模型,设置不同的潮气量,模拟临床上机械通气相关性肺损伤的发生,同时采用体内干预措施,通过分子生物学、病理学等手段,从动物水平探讨Stiml/Orail通路参与机械通气相关肺损伤肺水肿形成的机制研究,以期为临床呼吸机辅助治疗过程中减轻肺损伤提供强有力的理论依据,同时为寻求药物预防和治疗急性肺损伤提供新的研究思路和靶点。研究目的:通过建立机械通气相关性肺损伤大鼠动物模型,以探讨不同潮气量通气对大鼠肺组织Stiml、Orail和PKCa蛋白表达,以及支气管肺泡灌洗液(BALF)总蛋白和肺组织湿/干重比值(W/D)的的影响及BTP2预处理对上述指标和大鼠肺组织病理改变的影响。研究方法:清洁级雄性Wistar大鼠40只,体重200～220g,由山东大学医学院动物实验中心提供。随机分为5组,每组8只:对照组(C组),小潮气量组(VT=7ml/kg),大潮气量组(VT=40ml/kg),DMS0组(VT=40ml/kg,通气前2h,0.4ml/kg DMSO腹腔注射),BTP2组(VT=40ml/kg,通气前2h,lmg/kg BTP2腹腔注射)。实验前12h禁食,自由饮水。10%水合氯醛3.5ml/kg腹腔注射麻醉后,颈部正中行气管切开并置入气管导管。对照组仅做气管切开,不行机械通气;DMSO组和BTP2组分别于通气前2h,给予相应的处理,各组气管切开后接小动物呼吸机行机械通气,呼吸频率40次/min,吸呼比1:3,空气吸入,呼气末正压为0,通气4 h。对照组气管切开后4h,余4组通气结束后,腹主动脉穿刺放血处死动物。立即开胸,钳加右主支气管,行左支气管肺泡灌洗,每次2mL生理盐水,反复灌洗3次,收集支气管肺泡灌洗液(BALF),离心弃上清,-20℃冰箱保存,采用BCA法测定BALF总蛋白浓度。取右上肺叶置一80℃冰箱保存,备western blotting测定Stiml,Orail,PKC a相对蛋白浓度;右肺中叶称重,60℃放置72h,至恒重,测定湿/干重比值;余肺用4%多聚甲醛固定,备HE染色,病理学检查。研究结果:与小潮气量组和对照组比较,大潮气量机械通气导致严重肺损伤,肉眼观察肺组织表面有出血点,肺水肿明显,光镜下观察肺泡腔内充血,出血,水肿,肺泡壁断裂,大量中性粒细胞浸润;BTP2预处理能够减轻大潮气量导致的肺损伤,肺泡腔内出血,充血减轻,肺水肿减轻,中性粒细胞浸润减少。且与小潮气量组和对照组相比,大潮气量组BALF中总蛋白浓度增加,肺湿/干重比值增加,肺组织Stiml,Orail,PKC a蛋白表达增加(P<0.05)。与大潮气量组相比,BTP2组BALF中总蛋白浓度降低,肺组织湿/干重比值降低,肺组织Stiml,Orail,PKC a蛋白水平明显降低(P<0.05)。研究结论:大潮气量机械通气激活肺组织Stiml/Orail信号通路,PKCα蛋白水平明显增加,导致肺组织水肿,诱发急性肺损伤。BTP2能够抑制Orail通道,阻断Stiml/Orail信号通路的传导,肺组织PKCα蛋白水平降低,减轻大潮气量诱发的肺水肿。第二部分机械牵张对Stim1/Orai1蛋白的表达及肺内皮通透性的影响研究背景:维持肺气血屏障结构完整和功能正常是肺组织正常气体交换的根本保障,防止血液中物质进入肺泡腔,气血屏障完整性破坏可导致高通透性肺水肿。肺微血管内皮细胞是组成气血屏障的重要成分,内皮细胞的结构改变和通透性增加,严重影响肺组织正常的气体交换,导致病人出现呼吸功能障碍,甚至急性呼吸窘迫综合征。当炎症、缺氧、机械牵张等作用于肺组织时,内皮细胞感受到各种刺激,细胞通透性增加,出现微血管渗漏,水、蛋白质等物质通过内皮细胞进入肺泡腔,引发肺水肿。机械牵张种植于特定细胞培养板的肺内皮细胞模拟临床上机械通气的过程,从细胞水平观察和研究机械通气诱发肺水肿的可能机制。大幅度的机械牵张能够直接作用于肺内皮细胞,激活内皮细胞膜上的钙离子通道,诱发钙离子内流,直接导致细胞形态的改变和细胞间连接蛋白的变化,且钙离子浓度的变化早于细胞形态的改变和细胞间连接的变化。Stim1和Orai1是组成储存钙通道的两种主要蛋白质,参与调节钙离子的内流,而钙离子是维持正常细胞生理功能的重要阳离子,细胞内钙离子浓度的变化,通过多条信号传导通路,调节内皮通透性。PKC家族是细胞内重要的激酶,PKC的激活依赖细胞内钙离子升高,从胞浆中转位到细胞膜上,影响内皮细胞的多种细胞过程,包括细胞骨架和粘附分子,以及细胞间连接复合蛋白的表达,影响微血管通透性。机械牵张肺微血管内皮细胞,通过设置不同的牵张参数,模拟临床上呼吸机辅助治疗中,机械通气诱发急性肺损伤的过程,从细胞水平探讨机械牵张通过Stim1/Orai1通路调节钙离子内流,增加肺微血管内皮细胞通透性的可能机制。研究目的:通过机械牵张肺微血管内皮细胞,设置不同的牵张条件,模拟机械通气过程,探讨不同幅度机械牵张对Stim1、Orai1和PKC α蛋白表达的影响,以及牵张对细胞钙离子浓度变化和内皮细胞通透性的影响。通过应用BTP2抑制剂阻断Orai1通道,进一步探讨Stim1/Orai1参与机械牵张调节肺微血管内皮细胞通透性的可能机制。研究方法:肺微血管内皮细胞种植于Ⅰ型胶原纤维包被的Bioflex弹性膜细胞牵张板,待细胞覆盖90%时,进行预实验,随机分为3组,对照组、8%机械牵张组、18%机械牵张组,对照组不做牵张,其余两组牵张时间为2h,4h,牵张频率0.5HZ,牵张和放松比1:1;牵张结束后在冰上迅速进行蛋白裂解,提取总蛋白,用于Western Blotting检测Stiml蛋白。在预实验的基础上,将种植于胶原板的细胞随机分为4组:对照组,18%机械牵张组,二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)组(DMS0+18%机械牵张),BTP2组(BTP2+18%机械牵张);DMS0组和BTP2组分别于牵张前2h给予预处理;对照组不做牵张,余各组牵张幅度18%,机械牵张4h,牵张频率0.5HZ,牵张和放松比1:1;牵张结束即刻,收集细胞,部分细胞采用流式细胞仪测定牵张结束后即刻细胞内钙离子浓度;部分细胞提取总蛋白,western blotting测定细胞Stiml、Orail、PKC a蛋白水平;部分细胞经胰酶消化后,种入transwell小室,通过测定伊文氏蓝标记的白蛋白吸光度法评价肺微血管内皮细胞通透性的改变。研究结果:预实验结果显示,与对照组比较,8%机械牵张2h,4h,Stiml蛋白水平没有明显的改变;18%机械牵张组Stiml蛋白水平较对照组和小潮气量组明显增加,2h(P<0.05),4h(P<0.01)。根据预实验结果,选定18%牵张幅度作为实验条件。实验组结果显示:牵张4h后,18%牵张组较对照组细胞内钙离子浓度明显增加,内皮通透性增加,Stiml,Orail,PKCa蛋白水平明显增加(P<0.05)。BTP2能够明显降低机械牵张引起的细胞内钙离子浓度增加,与18%牵张组比较,内皮通透性增加不明显,且Stiml,Orail,PKC a蛋白水平降低。研究结论:18%的机械牵张,激活Stiml和Orail蛋白,细胞外钙离子内流,细胞内钙离子浓度增加,可能通过钙离子敏感的PKC a蛋白,进一步导致内皮通透性增加;BTP2阻断Orail钙离子通道,减少机械牵张导致的钙离子内流减少,依赖钙离子活化的PKC a蛋白表达减少,内皮通透性改善。