柳枝稷(Panicum virgatum L.),禾本科(Gramineae)黍属(Panicum),是一种多年生高秆草本C4植物。柳枝稷传统上常被用于水土保持和牧草等方面,近年来作为一种新兴的生物能源植物越来越引起人们的关注。柳枝稷具有分蘖能力强,根系发达等突出特性,可适应于多种严酷的生态环境。目前关于柳枝稷已有众多的研究报道,但是对柳枝稷分蘖方面的研究却较为少见,尤其是对分蘖调控功能基因挖掘方面尚未见相关报道。本实验通过鉴定筛选抗逆性好、适应性强的柳枝稷品种(系)作为诱变材料,利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变其单株种子,创制柳枝稷分蘖突变体;通过对其分析鉴定,筛选出分蘖差异显著,性状遗传稳定的突变体植株;同时利用转录组测序技术,分析筛选调控分蘖的差异基因,并对其进行基因克隆和功能验证。1.利用本实验室选育的柳枝稷不同品种(系)作为初始鉴定材料,通过对柳枝稷不同品种(系)的抗旱、耐酸碱以及耐贫瘠等性状进行鉴定分析,筛选出抗逆性强、适应性好的柳枝稷品种(系)作为诱变材料。结果发现,柳枝稷幼苗活力随干旱胁迫时间的延长而降低,当干旱胁迫时间超过12 d,土壤含水量低于3.7%时,大部分柳枝稷幼苗会因缺水而死亡;柳枝稷幼苗在p H值低于5或高于11时,生长将会受到抑制,甚至死亡,其中对碱性的适应力要明显高于酸性环境;柳枝稷对氮磷钾的需求量不高,但是适当增加氮肥可以提高柳枝稷的分蘖能力。总体上柳枝稷不同品种(系)对环境的抗逆性存在差异,其中以从美国品种‘Alamo’分离后代选育出来的品系抗逆性最好,尤其是西稷2号表现最为突出。2.利用EMS作为诱变剂,对西稷2号品系的单株种子进行诱变,通过对诱变后种子发芽率、幼苗成活率以及生理生化等指标进行统计分析。结果发现,柳枝稷种子的最适诱变条件是EMS浓度为1.0%左右,诱变时间4 h。将诱变后的种子播种在大田,并对其表型差异进行鉴定,筛选出了分蘖差异显著,遗传性状稳定的一批分蘖突变体。通过对突变体的进一步鉴定选择差异最为明显的一对柳枝稷突变体(Switchgrass L和Switchgrass M)进行转录组测序研究。3.利用RNA-seq技术,分析了选定柳枝稷突变体植株(Switchgrass L和switchgrass M)的基因表达情况。通过对其转录组比较,筛选出了2,877个表达差异明显的基因(DEGs)。对获得的差异表达基因进行分析,发现其主要集中在包括苯丙烷和能量物质的合成,碳水化合物的运输和代谢,植物激素信号转导等生理过程。对挑选的差异基因进行功能预测,筛选出了与PIN1、TB1、D10、D14等同源的分蘖调控基因。4.克隆了调控柳枝稷分蘖的两个差异基因Pv PIN1和Pv TB1,并对其功能进行验证。Pv PIN1基因属于PIN1家族,编码一个假定的生长素运输载体蛋白。利用NCBI数据库进行序列比对发现,Pv PIN1基因序列与水稻中的Os PIN1基因序列高度相似。利用RNAi和基因超表达技术调控Pv PIN1基因的表达量,对其功能进行验证。结果发现,干扰Pv PIN1基因的表达能显著的提高柳枝稷的单株分蘖数和降低柳枝稷的分蘖角,这与生长素极性运输抑制剂(TIBA)处理过的野生型表现一致。通过对Pv PIN1基因超表达和抑制表达能够导致柳枝稷根冠比及株型的变化,证明了Pv PIN1基因对分蘖和不定根起到了重要的调控作用。5.克隆了另一个调控柳枝稷分蘖的基因Pv TB1。该基因与玉米控制分蘖的TB1基因是同源基因,通过NCBI数据库的基因比对发现Pv TB1基因与其他植物的TB1基因具有相似的保守区域,均含有一个编码TCP转录因子的结构域。利用转基因技术对Pv TB1基因功能进行验证,发现Pv TB1基因的功能与水稻Os TB1基因相似,过量表达将显著地抑制柳枝稷分蘖的产生,且这种抑制作用能被6-BA解除。通过改变Pv TB1基因表达量可以调控柳枝稷的分蘖和株高等性状,证明了Pv TB1基因的表达对柳枝稷分蘖发生起到重要的负调控作用。6.此外,试验还利用国产和进口裂解膜转化柳枝稷(Panicum virgatum L.)愈伤组织,对裂解膜裂解时的压强、抗性愈伤率、分化再生苗及阳性转化率进行统计分析。结果发现国产裂解膜在裂解时压强的稳定性略低于进口膜,但其平均值差异不显著;除抗性愈伤率国产裂解膜显著低于进口膜外(P<0.05),其余各指标差异均不显著。因此,在柳枝稷基因枪转化法中国产裂解膜完全可以代替进口膜,可节约试验经费。