在植物漫长的进化过程中,周围的环境因素在自然选择下也为植物适应性生长提供了动力,形成了植物与环境信号的双向影响。在感知不断变化的光信号、温度信号、土壤中的渗透压和金属离子等外环境时,植物不仅在生长发育上为了适应这些变化有所改变(例如改变株高、叶片卷曲、分支增多等等),同时,这些环境信号也会刺激植物体内次生代谢产物的合成与分流。次生代谢是植物在长期进化过程中与生物和非生物因素相互作用的结果。次生代谢物的糖基化是一种常见的生物小分子化合物的修饰方式,在植物中广泛存在,催化这一反应的酶是一类UDP-糖基转移酶(简称UGTs)。该类糖基转移酶在植物中具有广泛的生物学功能。本文主要针对两个糖基转移酶基因UGT76F1和UGT71C3进行研究,发现它们分别参与了光和高温介导的植物适应性生长以及植物的系统获得性抗性,明确了它们调节植物生长和抗病反应的分子机制,为深入理解植物与生物和非生物环境互作的机理奠定了重要理论基础,同时也为农林作物的遗传育种和基因编辑提供参考。本文的主要研究内容和结果如下:1.UGT76F1基因通过IPyA糖基化修饰参与光和温度介导的植物下胚轴生长。通过对拟南芥UGTs家族1中能够响应光信号的成员进行筛选,发现UGT76F1基因明显受光诱导表达上调(https://genevestigator.com)。于是,克隆了该基因UGT76F1,构建其过表达载体,通过遗传转化获得多个独立的高表达的转基因纯合株系。同时,又利用CRISPR-Cas9技术获得多个独立的碱基缺失和碱基插入纯合突变体株系。在白光、红光和蓝光培养条件下,发现ugt 76f1突变体较野生型出现更长的下胚轴,而过表达体则出现相反变化,并且在黑暗条件下生长的UGT76F1过表达体表现出更多的光形态建成趋势。为了确认UGT76F1参与光信号途径,一方面调查了光受体phyA,phyB,cry1cry2突变体中UGT76F1的表达情况,证明了它受多种光受体调节;另一方面还调查了光受体下游光敏色素互作蛋白PIF4突变体中该基因的表达,发现UGT76F1基因在pif4突变体中上调表达,而在PIF4过表达体中下调表达,于是推测该基因受PIF4负调控。为了验证这一推论,通过酵母单杂交实验、ChIP实验和荧光素酶报告实验进一步证实了 PIF4与UGT76F1启动子直接结合并且负调节UGT76F1的表达。由于PIF4同时响应环境中的光信号和高温信号,推测UGT76F1也受高温调节。于是分别在22℃和28℃培养的pif4突变体和野生型中检测了UGT76F1基因的表达水平,发现野生型中28℃对UGT76F1的表达呈抑制效应,并且是依赖于PIF4的。不仅如此,遗传学实验结果显示,pif4ugt76f1双突变体能够恢复pif4单突变体的短下胚轴表型,而35S:PIF4/35S:UGT76F1则抑制单一过表达PIF4导致的长下胚轴表型。为了加深理解糖基转移酶UGT76F1发挥作用的分子机制,通过体内和体外的生化实验以及代谢分析,发现UGT76F1能够特异性地对生长素的主要前体吲哚丙酮酸(IPyA)进行糖基化修饰,形成IPyA葡萄糖苷(IPyA-Glc),而对活性生长素(IAA)本身却没有活性。分析野生型、UGT76F1突变体以及UGT76F1过表达体内的IPyA-Glc,发现与UGT76F1的生化功能相一致,突变体产生了更少的IPyA-Glc,而过表达体积累了更多的IPyA-Glc。同时还分析了pif4突变体中IPyA-Glc的水平,发现pif4突变体具有显著增高的IPyA-Glc水平,这一结果与PIF4负调控UGT76F1的结论是一致的。为了分析UGT76F1的生化功能是否对生长素动态平衡构成调节作用,通过LC/MS对植物体内的IAA进行了定量分析,发现UGT76F1的突变显著增加了IAA的积累,而UGT76F1过表达则降低了内源IAA水平。与此相一致的是,DR5:GUS染色显示在UGT76F1突变体中生长素信号增强而在过表达体减弱。说明UGT76F1能够通过IPyA糖基化控制IAA生物合成的代谢流,参与生长素稳态调节。先前已有研究报道PIF4是光温信号通路的整合因子,具有正调控生长素合成关键酶YUCs的功能。由于UGT76F1受PIF4负调控,本研究调查了 UGT76FI与YUCs的相互关系和不同作用效果,证实在控制下胚轴生长方面UGT76F1具有拮抗YUCs的作用。总之,本文的遗传和生化数据表明,UGT76FI通过IPyA糖基化从而参与生长素水平调节及光和高温介导的植物下胚轴伸长。提出UGT76F1受光敏色素互作蛋白PIF4负调控,并在调控拟南芥下胚轴方面与YUCs形成拮抗作用。IPyA糖基化作为调控生长素合成的关键“分水岭”,在植物应对环境变化和维持生长素动态平衡过程中发挥着重要作用。2.UGT71C3基因通过MeSA糖基化修饰参与植物系统获得性抗性。在本实验室前期工作中,孟霞飞硕士通过体外和体内实验证明拟南芥糖基转移酶UGT71C3可以将MeSA进行糖基化修饰,并初步表明该酶可能参与植物的SAR过程,但研究数据不够系统和完善。因此,本研究在前期基础上,对UGT71C3参与植物系统获得抗性的分子机制进行了深入探讨,补充完善了一些数据,对部分数据也进行了再验证。首先调查了拟南芥UGT71C3基因的表达模式,发现UGT71C3基因能够受SA 以及含无毒蛋白的Pseudomonas syringaepv.tomato DC3000(Pst DC3000)/avrRpt2强烈诱导。并且发现该基因在在幼苗和成苗的真叶中对Pst DC3000/avrRpt2呈诱导型表达模式,而在植物根部则呈组成型表达模式,表明该基因可能在叶片组织参与了对病原菌的响应。为了进一步研究UGT71C3在体内的生物学功能,事先将MeSA葡糖糖苷标准品与UGT71C3蛋白对MeSA的酶促反应产物通过LC/MS对比,结果一致,推测MeSA可能是其在体内的天然底物。在原有UGT71C3的T-DNA插入突变体基础上,本研究又利用CRISPR-Cas9技术获得了该基因的碱基缺失突变纯合体。利用UGT71C3的突变体和过表达体,检测了它们的SAR反应。发现在初次接种Pst DC3000/avrRpt2 和Pseudomonas syringae pv.maculicola ES4326(Psm ES4326)/avrRpt2两种不同的菌种以后,再次在系统叶片接种Pst DC3000和Psm ES4326时,突变体的SAR反应增强,而过表达体的SAR反应则减弱。这些数据表明UGT71C3在植物体内负调控SAR免疫反应。在此基础上,我们通过高效气相色谱与质谱技术进一步分析了突变体和过表达体中MeSA的含量。发现与野生型相比过表达体中显著减少了 MeSA积累,而ugt71c3突变体积累了显著更多的MeSA。由于SAR反应的启动最终是由SA引起,考虑到MeSA与SA的相互转变,在植物局部组织接种病原菌以后我们检测了系统叶片中SA的含量,发现ugt71c3敲除突变体比野生型积累的自由态SA和总SA显著增多,而UGT71C3过表达株系积累的自由态SA和总SA更少。说明UGT71C3通过糖基化MeSA影响了 SA的水平。与此相一致的是,发现ugt71c3敲除突变体中与SAR相关的抗病基因显著上调,而突变体中却显著下调。以上结果表明,UGT71 C3在病原菌浸染下,通过上调表达加强了对信号分子MeSA的糖基化,影响了体内的SA水平,进而负调控SAR反应。UGT71C3的这种负调节作用可能有助于保障植物系统获得抗性处于恰当的水平,可能是植物SAR反应的一种精细调节机制。因此,该研究丰富了 SAR的调节理论,同时也为植物其他免疫信号分子潜在的糖基化调节系统获得抗性的研究提供了启示。