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第一部分中国G6PD缺陷症新生儿筛查与G6PD基因突变位点分布目的:调查中国新生儿筛查人群,提供中国葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)缺陷症患者的G6PD基因突变位点的分布信息。方法:纳入2013年至2017年中国12个省29个新生儿筛查中心的G6PD缺陷症筛查常规酶活性筛查阳性新生儿10,357例,提取DNA,利用多色探针熔解曲线分析法(Multicolor melting curve analysis,MMCA)检测G6PD基因16个热点突变位点,MMCA法检测结果为阴性的DNA样本再进行G6PD基因全外显子测序,统计我国新生儿筛查人群中G6PD缺陷症的突变基因型分布情况。结果:所纳入的10,357例新生儿G6PD酶活性异常样本中,利用MMCA检测阳性的突变9,950例,占96.1%,共检出13种突变位点(c.95A>G、c.383T>C、c.392G>T、c.487G>A、c.493A>G、c.517T>C、c.592 C>T、c.871G>A、c.1004C>A、c.1024C>T、c.1360C>T、c.1376G>T、c.1388G>A)。G6PD酶活性异常但MMCA阴性的408例患儿中,278例样本全外显子测序成功,成功率68.1%,共检出17种突变位点,其中13种已报道突变位点(c.202G>A、c.593G>C、c.1003G>A等)和4个国内外尚未报道突变位点(c.152C>T、c.290A>T、c.697G>C、c.1285A>G)。我国新生儿最常见的G6PD基因突变位点分别为c.1376G>T、c.1388G>A、c.95A>G、c.1024C>T、c.871G>A。G6PD基因突变位点呈现不同的地区分布特征,其中四川、重庆、贵州、湖南、广西、广东、海南的前五位突变位点为:c.95A>G、c.871G>A、c.1024C>T、c.1376G>T、c.1388G>A,山东、陕西两省的热点突变分别为:c.95A>G、c.487G>A、c.1024C>T、c.1376G>T、c.1388G>A。结论:我国新生儿G6PD缺陷症共检出G6PD基因26种已知突变位点,最常见突变位点依次为c.1376G>T、c.1388G>A、c.95A>G、c.1024C>T、c.871G>A,基因突变位点分布存在一定的地域特征。首次报道我国G6PD基因存在4个新发突变位点:c.152C>T、c.290A>T、c.697G>C、c.1285A>G,须进一步阐明这些位点的致病性。第二部分分析G6PD基因c.697G>C突变位点的致病性目的:通过在模式细胞HEK293细胞内过表达G6PD基因4个新发突变型和野生型载体,并结合患儿临床信息、软件预测及蛋白结构分析,寻找G6PD基因4个新发突变位点中可能致病的突变位点。方法:针对G6PD基因全外显子测序发现的4个新发突变位点(c.152C>T、c.290A>T、c.697G>C、c.1285A>G),以pc DNA3.1载体为骨架,分别构建野生型和突变型过表达质粒,转染HEK293细胞。RT-PCR检测各组G6PD基因相对表达量,G6PD/6PGD酶活性比值法检测G6PD酶活性水平,根据细胞内基因表达与酶活性结果找出可能致病的突变位点。结合潜在致病突变患儿外周血样本G6PD酶活性检测结果,使用SIFT、Polyphen 2软件预测突变对G6PD蛋白的有害性,最后结合文献与Py MOL软件建模,分析突变可能影响的蛋白功能域。结果:成功构建了G6PD基因4个新发突变位点的突变型和野生型的pc DNA3.1-G6PD过表达质粒并转染至HEK293细胞。检测结果显示,HEK293细胞内的c.697G>C突变组G6PD基因表达水平高于WT对照组4倍,而G6PD酶活性低于WT组30%。回顾分析G6PD基因c.697G>C突变患儿临床信息发现,三位携带有c.697G>C突变的患儿血G6PD酶活性残余程度均在10%-60%,为WHO III级突变。SIFT与Polyphen 2软件预测结果均提示c.697G>C突变可能影响G6PD蛋白功能;Py MOL软件建模分析G6PD蛋白结构发现,c.697G>C位于G6PD蛋白的结构性NADP+结合域,可能影响G6PD蛋白热稳定性。结论:G6PD基因c.697G>C为潜在致病突变,可大致归类为WHO III级突变,且其极可能通过影响G6PD与结构性NADP+的结合而对G6PD蛋白功能造成损害。第三部分G6PD基因c.697G>C位点突变致细胞G6PD酶活性下降目的:验证G6PD基因c.697G>C位点突变导致G6PD酶活性下降。方法:针对G6PD基因c.697G>C位点设计sg RNA与突变同源臂序列,构建CRISPR/Cas9基因编辑双质粒系统,并应用CRISPR/Cas9构建G6PD基因c.697G>C突变的HEK293细胞株与红白血病K562细胞株;利用q RT-PCR、Western-blot检测c.697G>C突变对G6PD基因表达影响;CCK8法检测c.697G>C突变对细胞增殖的影响;G6PD/6PGD酶活性比值法检测c.697G>C突变对G6PD酶功能造成的影响;结晶紫染色与Annexin V-APC/7-AAD检测c.697G>C突变HEK293与K562细胞株对氧化活性药物伯安喹的耐受情况。结果:针对G6PD基因c.697G>C位点设计3对sg RNA并构建p X458-sg RNA质粒,选取编辑效率最高的p X458-Sg3与同源臂质粒共转染HEK293细胞和K562细胞。单克隆细胞DNA测序结果验证,成功构建G6PD基因c.697G>C纯合突变的HEK293细胞株及K562细胞株;q RT-PCR及Western-blot检测发现G6PD基因c.697G>C突变不影响HEK293细胞及K562细胞的G6PD基因表达;CCK8检测显示,G6PD基因c.697G>C突变使红白血病细胞K562增殖受到明显抑制,而HEK293细胞增殖无影响;G6PD/6PGD酶活性检测显示,G6PD基因c.697G>C突变导致HEK293细胞及K562细胞G6PD酶活性降低20%-30%;结晶紫染色与Annexin V-APC/7-AAD检测结果显示G6PD基因c.697G>C突变HEK293细胞及K562细胞对伯安喹的耐受能力在200μM及250μM以上时显著下降。结论:HEK293与K562细胞内G6PD基因c.697G>C突变导致G6PD酶活性降低,抗氧化损伤能力减弱,验证为致病突变。