基于表面改性石墨烯的生物安全性研究

来源 :中国科学院研究生院(过程工程研究所) | 被引量 : 0次 | 上传用户:xtb0909
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考察表面功能化对石墨烯衍生物生物学效应的影响对其安全应用具有十分重要的意义。本论文通过构建具有不同表面性质的石墨烯衍生物,从巨噬细胞的内吞、活性、应激性三方面对其体外生物学效果进行评价。在此过程中还发现了聚乙二醇修饰的氧化石墨烯(nGO-PEG)诱导细胞因子分泌的特殊性质,从分子层面阐述了与该性质相关的内在机制,并联合体内结果进行了完整的验证。论文具体开展的研究工作如下:1.构建了具有不同表面性质的石墨烯衍生物,考察了它们对巨噬细胞活性的影响。在原始氧化石墨烯(nGO)的基础上,利用物理化学修饰策略,得到表面用聚乙二醇(PEG)、聚乙烯亚胺(PEI)和牛血清白蛋白(BSA)改性的石墨烯衍生物。相对于原始的nGO, PEG和BSA的修饰在降低细胞摄取的同时也提高了它们的生物兼容性,而nGO-PEI在低浓度下易被细胞大量摄取,但随着浓度增加,它对细胞活性的影响导致其内吞量不再上升。nGO、nGO-BSA及nGO-PEI三者进入胞内后,影响细胞活性的机制是:通过崩解线粒体膜电位,引起胞内活性氧的上升和细胞色素C的转移;继而启动凋亡相关蛋白酶的激活,最终诱导细胞发生凋亡。上述研究表明,表面改性的策略可以改变石墨烯与细胞间的作用,引发不同的生物学效应。2.深入研究了石墨烯衍生物对巨噬细胞应激性行为的影响,发现了nGO-PEG特殊的细胞激活行为。与内吞的nGO衍生物相比,nGO-PEG在不被内化的情况就可以刺激巨噬细胞分泌大量与细胞活化相关的细胞因子。nGO-PEG的这一特性具有如下几个特点:只有将PEG偶联至nGO表面后才会出现,将二者简单共混或添加PEG对细胞无活化作用;随着时间的延长,作用后期细胞产生的负反馈效应会减缓细胞因子的分泌,并使得nGO-PEG的二次激活作用不明显:与材料的维度有直接关系,PEG化的二维材料(如nGO和MoS2)相对其他维度具有更强的促细胞因子分泌性质;nGO-PEG与细胞膜的相互作用不仅不会破坏膜的完整性,还会使细胞膜流动性加快,促进细胞的迁移。3.借助分子模拟、基因芯片及多基因定量策略,阐明了nGO-PEG促细胞因子分泌的机制。分子模拟数据揭示了nGO-PEG与细胞膜的两种作用模式,即通过部分嵌插和表面摩擦的方式游走于细胞膜,并能与膜上细胞因子相关的蛋白相互作用,诱发内部信号通路的激活。抗体封闭和siRNA干扰实验确认了整合素(Integrin) (β8作为起始位点在细胞因子分泌中起到的关键作用。Integrin β8的上调使得黏着斑激酶(FAK)发生自磷酸化,并募集更多的黏着斑蛋白;并通过MAPK和P13K相关途径激活核转录因子,最终将nGO-PEG的胞外力学信号转换成内部的化学信号,促进细胞因子的大量分泌。4.基于nGO-PEG的体外结果,系统评价了nGO-PEG腹腔注射后在体内的生物安全性。短期毒性研究表明:腹腔内细胞因子水平的表达存在浓度依赖性,并且细胞因子和炎性细胞量随时间的延长呈逐渐下降趋势:在不同浓度下,除了肝指标ALP稍有增加,nGO-PEG对相关生化、血液学指标及脏器无明显影响。进一步的长期毒性研究表明:nGO-PEG的促细胞因子分泌性质对注射次数无依赖性,多次注射后体内代谢及负反馈效应导致细胞因子分泌及炎性细胞的募集效果较单次注射降低;长期注射nGO-PEG对肝脏和腹膜注射部位也存在一过性的影响,并且导致血液中炎性细胞的增加。该方面的研究也表明需要注意PEG化材料激活细胞产生炎症的特殊性质,为合理设计安全高效的二维材料奠定基础。
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