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目的:对体外培养C57小鼠密质骨来源的间充质祖细胞(mesenchymal progenitor cells,MPC)的方法进行研究,建立适合小鼠MPC增殖的培养方案;探讨小鼠密质骨来源的MPC体外向神经元样细胞定向诱导分化的实验研究。方法:取材方法选择健康C57雌性小鼠,清洁级,3周龄,18±2 g,取股骨、胫骨碎片经Ⅱ型胶原蛋白酶消化后作为MPC来源。分组取得消化后的骨碎片,选取干细胞培养中经常使用的DMEM/F12培养基、IMDM培养基、α-MEM培养基和TBD公司生产的胎牛血清(FCS)、GIBCO公司生产的胎牛血清,按不同搭配进行培养,随机分为DMEM/F12+10%TBD胎牛血清组、DMEM/F12 +10%GIBCO胎牛血清组、IMDM+10%TBD胎牛血清组、IMDM +10%GIBCO胎牛血清组、α-MEM +10%TBD胎牛血清组、α-MEM +10%GIBCO胎牛血清组,共6组,每组培养6份。培养方法将小鼠密质骨碎片置入六孔板中,按不同分组加入相应培养液,放入37℃、5% CO2的培养箱内,48 h后首次换液,以后每隔2-3 d换液一次。每天观察细胞生长情况,当生长最好的实验组原代(P0)细胞细胞贴壁超过培养板底面积80%时吸出培养液,用含0.04% EDTA的0.25%胰蛋白酶消化、收集细胞,按固定细胞浓度传入培养瓶。传代后以后每2-3 d换液一次,当生长最好的实验组细胞贴壁超过培养瓶底面积70%-80%时按固定细胞浓度1×103个/cm2传代。MPC纯度鉴定采用流式细胞术分析,单标法检测第三代(P3)MPC,取FITC标记的兔抗鼠CD29、CD31、CD44、CD90和PE标记的兔抗鼠CD45、CD106作为标记物,平行对照组为加入同型对照抗体的MPC。考虑到实验的需要以及研究生学习阶段时间有限,只选择采用优化方案进行培养的MPC进行纯度鉴定。MPC的多向分化鉴定对MPC进行向骨细胞、脂肪细胞的定向诱导分化,验证其具有干细胞的多向分化潜能,用茜素红和油红O染色检测诱导分化结果。同样只选择采用优化方案进行培养的MPC进行多向分化能力鉴定。MPC定向诱导成神经元样细胞的方法取优化方案培养的P4代MPC,用微环境体液(神经元原代培养上清液)进行诱导,取诱导24 h后的MPC作为实验标本。对其进行形态学观察;免疫细胞化学检测神经元特异性标志物神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase ,NSE)及神经丝蛋白(neurofilament protein,NF)的表达情况,同时进行免疫荧光分析。结果:C57小鼠间充质祖细胞(MPC)体外优化培养原代培养5 d后,可见培养器皿底部有细胞贴壁生长,以圆形和扁圆形为主,10 d后贴壁细胞逐渐铺开,形成梭形或多角形,形态饱满,折光性强,细胞间无重叠,有接触抑制现象;传代后细胞形态趋于一致,大部分为梭形,排列紧密,生长旺盛。当某个实验组细胞贴壁超过底面积70%-80%时,对所有细胞进行传代计数,观察3代。结果发现在每一代的细胞计数中,DMEM/F12+10% GIBCO胎牛血清组的细胞数量都超过其他各组,通过统计学检验验证DMEM/F12+10% GIBCO胎牛血清组细胞数量与其余各组相比有显著差异(P﹤0.05)。说明DMEM/F12+10%GIBCO胎牛血清更有利于MPC的体外培养增殖。MPC纯度鉴定优化方案培养的MPC表达间质细胞标记CD29、CD44、CD90和CD106,不表达造血细胞标记CD31和CD45。说明得到的是同源性好、纯度高、排除了造血干细胞影响的MPC。MPC多向分化能力鉴定在用优化方案培养的MPC定向诱导成骨细胞的实验中,通过茜素红染色发现诱导后细胞外基质中大量钙盐沉积;在定向诱导成脂肪细胞的实验中,通过油红O染色发现细胞中出现的脂滴被染成点状红色,表明我们得到的MPC能向骨细胞、脂肪细胞分化。说明我们得到的是活性好、具有多向分化能力的MPC。MPC体外向神经元样细胞定向诱导分化经诱导24 h后,MPC细胞形态发生变化,自胞体有突起长出,各细胞突起长短不一,类似神经元。免疫细胞化学检测结果表明,诱导后MPC的NSE(73.73%±9.88%)及NF(60.26%±7.19%)均阳性表达;免疫荧光检测也证实免疫细胞化学检测的结果。结论1.实验证明,用DMEM/F12+10% GIBCO胎牛血清为培养液进行小鼠密质骨来源的MPC体外培养最有利于其数量的扩增,得到的是同源性好、纯度高、增殖活力强、具有多向分化潜能的MPC细胞群。2.通过微环境体液(神经元原代培养上清液)诱导的方法能够使小鼠密质骨来源的MPC定向分化为神经元样细胞。