紫山芋多糖的分离纯化及生物活性研究

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天然多糖由于其独特的生物学功能和安全、绿色无毒副等优点,受到人们的广泛关注,现已有部分多糖用于临床。紫山芋为药食同源性甘薯属草本植物,常被用于提取花青素;然而,提取花青素后的紫山芋渣尚未深入开发。本文拟以紫山芋渣为原料,利用超声波-酶解协同法提取紫山芋活性多糖,并通过响应面法优化多糖提取工艺;通过离子交换和葡聚糖凝胶柱层析等方法分离纯化紫山芋多糖,并通过色谱和光谱等技术对紫山芋多糖的结构特征进行研究;利用体外活性试验探讨了紫山芋多糖的抗氧化、降血压和抗肿瘤活性,并对紫山芋多糖的抗肿瘤分子机制进行了初步探讨。在单因素试验、PB试验设计和最陡爬坡试验的基础上,利用响应面法优化的紫山芋多糖最佳提取工艺为:液料比23.7mL·g-1、超声波功率207W、超声时间30min、加酶量(-淀粉酶)60U·g-1、提取温度66.6℃、提取时间1.5h,在此条件下,紫山芋多糖的提取率可达5.43%;扫描电子显微镜(SEM)和红外光谱(FT-IR)分析表明,超声波协同酶法使紫山芋渣内部的孔洞增多,促进了紫山芋多糖的释放,且未造成紫山芋多糖降解;抗氧化试验表明,与传统提取方法相比,超声波协同酶法提高了紫山芋多糖的抗氧化活性。紫山芋粗多糖经纯化,得到PSPP-Ⅰ、PSPP-Ⅱ和PSPP-Ⅲ3个组分,分子量分别为33.3kDa、17.8kDa和75.3kDa,FT-IR和1H-NMR结果显示,3种多糖组分均为酸性吡喃型聚糖,由β糖苷键链接;GC和GC-MS分析发现,PSPP-Ⅰ单糖组成为鼠李糖:木糖:葡萄糖:半乳糖=15.96:0.91:2.43:1.00,PSPP-Ⅱ单糖组成为鼠李糖:半乳糖=2.97:1.00,PSPP-Ⅲ单糖组成为鼠李糖:木糖:葡萄糖:半乳糖=3.51:1.92:1.44:1.00。各多糖组分的体外抗氧化试验表明,紫山芋多糖各组分均具有较强的抗氧化活性,其中,PSPP-Ⅲ清除DPPH自由基能力最强,其EC50为0.388mg/mL;PSPP-Ⅱ螯合Fe2+能力最强,其EC50为1.1mg/mL;另外,PSPP-Ⅰ、PSPP-Ⅱ和PSPP-Ⅲ还表现出良好的还原能力;体外ACE抑制活性分析发现,紫山芋多糖各组分表现出良好的降血压活性,PSPP-Ⅰ、PSPP-Ⅱ和PSPP-Ⅲ的IC50分别为2.16、2.40和2.17mg/mL。体外抗肿瘤试验表明,PSPP-Ⅰ对胃癌SGC7901抑制效果最为明显,IC50为375.94μg/mL,且对人表皮细胞HaCat无显著毒性,表明紫山芋多糖PSPP-Ⅰ具有开发抗肿瘤多糖药物的潜力。进一步试验发现,PSPP-Ⅰ能诱使胃癌SGC7901细胞提前进入了凋亡期;扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)结果发现,经PSPP-Ⅰ处理后SGC7901细胞缩小,细胞绒毛脱落,并伴随有脱落小体产生,细胞质固缩,核解离,染色质成块聚集至细胞膜内侧,表现出凋亡细胞的典型特征;流式细胞仪分析发现,经IC50浓度的PSPP-Ⅰ处理12h后(IC50=375.94μg/mL),SGC7901细胞早期凋亡率增加了14.9%,细胞周期发生紊乱,出现亚二倍体(Sub-G1)凋亡小峰,并引起SGC7901细胞线粒体膜电位下降91.5%;Real time qPCR分析发现,经PSPP-Ⅰ处理36h后,TP53、caspase-3、bax和bcl-2表达量分别为初始量的2.61倍,3.09倍,2.02倍和0.45倍。
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