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目的:本实验从梗阻性黄疸患者粪便中分离培养菌株,通过体外观察检测大黄素对各种不同菌株的作用,筛查出大黄素作用明显的菌株。进而通过动物体内实验验证大黄素对此菌株的影响及对梗阻性黄疸肝肾损伤的作用。旨在从调节肠道菌群角度解析大黄素在OJ治疗中的作用机制,为进一步研究OJ及其并发症的发生机制和大黄素治疗机制提供实验依据和理论基础。方法:1.收集我院2018年3月至2019年3月采用微创外科技术治疗胆囊结石合并胆总管结石的梗阻性黄疸患者的术前粪便50份。将取得样本用不同培养基分离培养,高通量分离得到患者胆汁和粪便中的菌株。大黄素体外筛选分离的菌株,观察大黄素对不同菌株的作用,并筛选出受明显调节的菌株。检测筛选出菌株的生长曲线、大黄素对其作用的MIC、不同倍数MIC下该菌株CFU值变化,以确定大黄素对该菌株的作用。2.将40只SD大鼠随机分为5组,分别为空白对照组(control,CON)、胆总管结扎手术组(bile duct ligation,BDL)、胆总管结扎手术后灌胃大黄素组(emodin,EMO)、胆总管结扎手术后灌胃大黄素和Lysinibacillus sp.菌株组(emodin&Lysinibacillus sp,EMO+LY.SP)、胆总管结扎手术后灌胃Lysinibacillus sp.菌株组(Lysinibacillus sp,LY.SP)。各组大鼠造模7天后收集大鼠粪便,14天后,处死各组大鼠,收集血清、肝脏组织、肾脏组织、粪便。用以检测血清生化指标以及各类胆汁酸含量;分析肝脏、肾脏组织的病理损伤情况,胆汁酸相关受体的表达情况以及转录组学的变化情况;以及粪便菌群的宏基因分析。结果:1.菌群筛选结果截至2019年3月,50份患者提供样本中共分离培养22份,分离得出菌株1400余株,菌种200余种。运用Alamar Blue显色实验,向分离的出不同需氧菌株中添加大黄素(0.3g/L),观察显色变化后OD600数值差异,根据差异明显程度筛选出大黄素作用明显菌株。经3次以上重复Alamar Blue显色实验,选定菌株XD114即Lysinibacillus sp.(以下称LY.SP菌株)。检测该菌株的生长曲线以及在大黄素作用下的MIC,最终确定大黄素对该菌株作用的MIC为0.3g/L并在4倍MIC时作用的CFU作用最明显。该菌株为首次从OJ患者体内分离得到,对于该菌株与人体代谢有关机制的关系仍知之甚少,本实验首次探讨了LY.SP菌株在OJ疾病的作用,以及大黄素对于该菌的作用在OJ中的影响。2.大鼠血清血生化及胆汁酸结果血清生化共检测血清尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(ASL)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)指标。与对照组相比,手术组及菌株组的以上各项检测指标均增加(P<0.05),经大黄素灌胃后大黄素组较手术组各项指标则均减少(P<0.05),大黄素加菌株组也较手术组各项指标有所减少(P<0.05)。将所收集的血清进行胆汁酸谱检测,检测各组血清中石胆酸(LCA)、胆酸(CA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、脱氧胆酸(DCA)、甘胺胆酸(GCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、牛磺胆酸(TCA)、牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)、牛磺脱氧胆酸(TDCA)、牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)、熊脱氧胆酸(UDCA)、甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)的变化水平。在BDL组中血清TDCA、CA、GCA、GCDCA、TCA、TCDCA较CON有明显增多(P<0.01),而大黄素治疗能显著逆转手术带来的血清胆汁酸变化(P<0.01)。LY.SP菌株能使血清中的牛磺结合类胆汁酸(TCA,TCDCA,TUDCA)显著升高,而大黄素能明显降低LY.SP菌株引起的以上血清胆汁酸的增多(P<0.05)。LY.SP菌株明显加重了胆总管结扎导致的血清血生化指标的变化,在TBTL、DBIL指标中甚至超过BDL组的三倍。而大黄素对LY.SP菌株的抑制则显著降低了LY.SP菌株和胆总管结扎所导致的血生化指标的增高。3.大鼠肝脏组织病理学改变以及胆汁酸相关受体FXR、Gpbar-1的表达变化各组大鼠的病理组织切片结果在200倍显微镜视野下可观察到:BDL组较CON组出现明显的大片肝脏小胆管样增生与纤维化,并伴有炎细胞浸润,汇管区小胆管样上皮细胞增生,毛细胆管扩张,小胆管、纤维组织增生明显,纤维间隔形成。LY.SP组同BDL组有类似表现,而大黄素灌胃后,在EMO组和EMO+LY.SP组中能明显看到肝脏纤维化较BDL组和LY.SP组减少。在肝脏FXR、Gpbar-1的基因表达方面,RT-PCR结果显示:与CON组相比,BDL组和LY.SP组有显著的降低(P<0.01);而EMO组和EMO+LY.SP组则较BDL和LY.SP组有所增高。同时肝脏FXR及Gpbar-1的免疫组化结果与RT-PCR结果趋势相符。4.大鼠肾脏组织病理学改变以及胆汁酸相关受体FXR、Gpbar-1的表达变化大鼠肾脏病理切片在400倍显微镜下可观察到:与CON组相比,BDL组和LY.SP组中可见部分局灶性阶段性肾小球硬化,部分上皮细胞脱落、坏死,伴间质炎性细胞浸润,胞浆崩解;EMO组和EMO+LY.SP组中无明显纤维化表现,细胞上皮细胞脱落减少。肾脏FXR、Gpbar-1基因表达方面,RT-PCR结果显示与CON组相比,BDL组、LY.SP组表达明显降低(P<0.01);EMO组和EMO+LY.SP组相较BDL组和LY.SP组,能够显著提升FXR、Gpbar-1的表达降低。在肾脏FXR、Gpbar-1基因免疫组化的结果中亦有相同趋势。在肝脏和肾脏中胆汁酸受体相关表达的方面我们发现LY.SP菌株较BDL组,更能够抑制Gpbar-1在肝脏和肾脏中的表达。5.大鼠肝脏、肾脏组织的转录组学变化肝脏内各组的基因表达的相似度较高,肾脏内各组之间相似度次之,肝脏和肾脏各组间的基因表达情况具有明显差异。在肝脏组织中,各组基因表达较为接近无明显差异,肾脏组织中CON组与EMO组表达较为类似,而与其余三组相比则差异较大。胆总管结扎通过影响该通路中基因的表达,从而影响大鼠的脂肪和胆汁酸代谢,而大黄素干预能调整被胆总管结扎影响的基因从而使整体基因表达更趋向于与对照组类似。结论:1.大黄素能够抑制OJ患者部分肠道菌群的生长,其中最为明显的是Lysinibacillus sp.菌株。2.肠道Lysinibacillus sp.菌株加重OJ大鼠肝肾功能损伤,改变大鼠血清胆汁酸谱、胆汁酸相关受体FXR、Gpbar-1的表达,与转录组学的改变具有相关性。3.大黄素能够改善OJ大鼠肝肾功能,调节OJ大鼠血清胆汁酸谱的改变、胆汁酸相关受体FXR、Gpbar-1的表达以及转录组学变化。4.大黄素能够逆转Lysinibacillus sp.菌株对梗阻性黄疸大鼠的肝肾功能损伤。