肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是严重危害人类健康的恶性疾病,其致死率位居肿瘤致死率第二。我国的肝细胞肝癌患者人数约为世界的55%,总体发病率位居国内肿瘤发病率第三位。肝细胞肝癌可由多种致病因素引起其中乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)慢性感染是80%肝细胞肝癌的诱发因素。HBV是一种部分双链DNA病毒,感染肝细胞后,可通过多方面途径引起细胞内基因表达及信号通路的改变,进而促进肿瘤的发生发展。一方面,HBVDNA整合于宿主基因组影响基因的稳定性或激活癌基因/灭活抑癌基因,影响细胞的生长、凋亡等过程;另一方面,X、S等HBV编码蛋白可通过反式激活作用或蛋白-蛋白相互作用,激活信号通路,影响细胞生长、迁移相关基因的表达;同时,HBV间接调控肝脏免疫细胞功能,介导肝脏微环境炎症反应,促进肿瘤的发生。尽管已有大量研究揭示HBV诱发肝细胞肝癌的过程及机制,但目前的治愈率仍有待提高,因此,深入研究HBV介导肝细胞肝癌的发病机制具有重要意义。ZHX2是近年发现的参与肝细胞肝癌、白血病等多种肿瘤的抑癌基因。前期动物实验及细胞研究证实ZHX2抑制甲胎蛋白(alphafetoprotein AFP)和Glypican3(Gpc3)等胚胎发育相关基因的表达。本实验室前期研究证明,在肝脏癌旁组织中ZHX2的核表达水平明显高于肿瘤组织,同时,ZHX2通过抑制细胞周期蛋白CyclinA和CyclinE的表达,从而抑制肝癌细胞的生长。另一项研究发现,ZHX2通过与NF-Y结合于多药耐药蛋白(Multi-Drug Resistance 1,MDR1)编码基因的启动子区域抑制其表达,增强肝癌细胞对抗肿瘤药物的敏感性。上述研究强烈提示ZHX2是新型肝癌抑癌基因,在HCC发生发展中发挥重要作用。然而,ZHX2是否在HBV相关HCC中发挥作用尚不明确。近期文献证实,在霍奇金淋巴瘤中,包含ZHX2基因的8号染色体与4号染色体发生染色体重组,引起ZHX2表达降低;在一项家族性皮质基底核退化症病例分析中,ZHX2表达水平下降并可能被miR-4277调控。但在HBV相关肝细胞肝癌中,作为抑癌基因的ZHX2受何种调控及其机制尚未被报道。综上,本研究利用肝癌组织、小鼠模型以及体外肝癌细胞系,通过多种手段深入探究ZHX2在HBV相关肝细胞肝癌中的表达及调控方式,从而以新的角度揭示HBV促进肝细胞肝癌发生发展的相关机制。获得如下主要结果:一、HBV阳性肝脏组织中ZHX2的表达水平明显降低为研究HBV对ZHX2的可能调控作用,本研究首先在临床肝癌组织、HBV转基因鼠肝组织中比较HBV感染对ZHX2表达水平的影响。1.临床肝癌组织标本检测发现HBV阳性肝癌组织内ZHX2表达明显减低收集共36例肝癌组织和癌旁组织标本,qRT-PCR检测ZHX2表达水平。结果显示,与血清学检测HBV阴性患者相比,HBV阳性患者的肝癌组织中ZHX2高水平表达比例显著降低(11/17,65%vs.1/7,14%,χ2=54.42,df=1,P<0.0001)。在HBV阳性患者中,肿瘤组织内的ZHX2表达水平明显低于癌旁组织(4/16,25%vs.9/12,75%,χ2=50,df=1,P<0.0001),与 ZHX2 的抑癌基因作用相一致。2.HBV转基因小鼠肝细胞内ZHX2表达显著降低分别取6只C57B/6野生型小鼠和HBV转基因(HBV-Tg)小鼠的肝脏,离心法分离肝实质细胞。qRT-PCR和Western blot检测肝组织和纯化肝实质细胞的ZHX2表达情况。结果表明,HBV转基因小鼠的肝组织内的ZHX2 mRNA明显低于野生型小鼠(P<0.05);与此一致,HBV转基因小鼠的肝实质细胞内ZHX2mRNA及蛋白表达水平也明显低于野生型小鼠肝实质细胞(P<0.01)。二、HBV及其编码蛋白过表达明显抑制肝癌细胞系ZHX2表达,其中HBx作用最强为进一步验证HBV对ZHX2的调控作用,本研究在不同肝癌细胞系中过表达HBV及其编码蛋白,并检测ZHX2。1.HBV感染明显抑制肝癌细胞的ZHX2表达纯化HBV病毒,感染稳定表达HBV受体NTCP的HepG2-NTCP细胞系,分别收取感染3天和5天后的HepG2-NTCP细胞和上清。ELISA法检测上清中-HBsAg表达情况,并且分别通过RT-PCR、qRT-PCR和Western blot方法检测细胞内pgRNA、HBx和ZHX2表达水平。结果显示,纯化的HBV成功感染HepG2-NTCP细胞。与未感染HBV的细胞相比,感染3天和5天后的细胞内ZHX2 mRNA和蛋白表达水平均明显下降。2.HBV及其不同编码蛋白过表达显著抑制不同肝癌细胞系的ZHX2表达分别在HepG2、SMMC7721、QSG7701三个肝癌细胞系中,过表达1.1倍HBV基因组质粒pcDNA3-HBV1.1和HBV编码蛋白质粒pcDNA3-preS2-HA、pcDNA3-HBx-HA、pcDNA3-HBc-HA 以及空载体质粒 pcDNA3。转染 48 小时后,以RT-PCR和Western blot方法检测ZHX2表达。结果表明,与阴性对照细胞相比,过表达1.1倍HBV及preS2、HBx、HBc的细胞内ZHX2mRNA和蛋白表达水平均显著降低,其中,转染HBx细胞的ZHX2降低水平最为明显。3.干扰肝癌细胞系HBV编码蛋白后ZHX2表达水平明显升高合成针对preS2、HBx、HBc的反义寡核苷酸,分别转染整合有HBV基因组的HepG2.2.15细胞,RT-PCR和Western blot方法检测细胞的preS2、HBx、HBc和ZHX2表达。结果显示,反义寡核苷酸转染有效干扰preS2、HBx、HBc表达。与转染随机设计的反义寡核苷酸对照细胞相比,干扰preS2、HBx、HBc表达后,HepG2.2.15细胞内ZHX2 mRNA和蛋白表达均显著升高,其中,干扰HBx表达后,ZHX2水平上升现象最为明显。综上,以上体内外实验结果说明,HBV及其编码蛋白明显抑制肝癌细胞中ZHX2表达,其中HBx对ZHX2的调控作用最为明显。三、HBV通过HBx限制ZHX2对肝癌细胞生长的抑制作用为进一步探究HBV是否影响ZHX2的功能,本研究利用小鼠模型和肝癌细胞系进行系列实验,发现:1.HBx显著限制ZHX2对荷瘤鼠体内肝癌细胞脏长的抑制作用小鼠肝癌细胞株H22皮下注射,制备BALB/c荷瘤小鼠,待肿瘤直径达3mm,分别瘤内注射等量 pcDNA3(20μg),pcDNA3+pcZHX2(10μg+10μg),pcHBx+pcZHX2(10μg+10μg),并测量肿瘤直径,12天后取肿瘤并称重。RT-PCR和Western blot结果证明,瘤内注射pcHBx和pcZHX2质粒后,HBx和ZHX2表达水平明显升高。肿瘤生长曲线和瘤重测量结果均显示,与阴性对照组相比,单一注射ZHX2可显著抑制肿瘤细胞生长,加入HBx后肿瘤生长明显加快并且与阴性对照组相近(P<0.05)。2.HBx明显消除ZHX2对体外肝癌细胞系增殖的抑制作用在HepG2细胞中转染与瘤内注射组别相同的质粒,48h后分别进行EdU染色、Western blot。荧光显微镜观测发现,与转染阴性对照细胞相比,高表达ZHX2的细胞中,EdU阳性染色细胞比例明显降低,而HBx、ZHX2共转染细胞内的EdU阳性染色细胞比例显著回升(P<0.05),提示HBx破坏了 ZHX2对肝癌细胞生长的抑制作用。PCNA表达检测进一步验证了上述结果:与ZHX2过表达细胞相比,HBx与ZHX2共转染细胞内细胞增殖相关抗原PCNA表达明显恢复。以上体内外研究结果表明,HBx抑制ZHX2的表达并且限制ZHX2对肝癌细胞生长的抑制作用。但是对于HBx调控ZHX2的机制仍知之甚少。有研究报道,多种microRNA可能参与调控ZHX2的表达因此本研究推测可能有microRNA参与HBV对ZHX2的抑制作用过程中。四、HBV尤其是HBx通过上调miR-155促进肝癌细胞生长1.miR-155可能是HBx抑制ZHX2表达的关键miRNA为探索在HBV抑制ZHX2过程中可能参与的microRNA,本研究首先利用BEL-7402肝癌细胞系过表达pcDNA3-HBx,通过microRNA microarray分析差异表达的microRNA。同时,通过microRNA预测网站(www.microrna.org)分析靶向作用于ZHX2基因的microRNA。结合芯片分析结果和microRNA预测结果筛选,发现miR-155是唯一在HBx过表达细胞中升高2倍以上、并可通过种子序列结合于ZHX2 3’UTR的microRNA,提示HBx通过miR155抑制ZHX2表达。为验证上述假说,本研究开展一系列体外实验及动物和临床肝组织检测。2.HBV尤其是HBx明显促进肝癌细胞miR-155表达为确定HBV对miR-155的调控作用,同上收集HBV感染3天和5天后的HepG2-NTCP细胞,qRT-PCR检测miR-155表达。结果显示,与HBV未感染细胞对比,HBV感染明显促进肝癌细胞系miR-155表达(P<0.05)。进一步在HepG2、SMMC7721、QSG-7701肝癌细胞系中转染HBx质粒,qRT-PCR结果表明,与阴性对照细胞相比,HBx过表达后细胞内miR-155表达水平明显上升,提示HBV,尤其是HBx促进肝癌细胞中miR-155表达。为验证上述结果,在HepG2.2.15肝癌细胞系中脂质体转染针对HBx的反义寡核苷酸,qRT-PCR结果显不,与对照相比,干扰HBx表达后HepG2.2.15细胞内miR-155水平明显下降,反向证明了HBx对miR-155的促进作用。3.HBV转基因小鼠肝细胞miR-155水平显著增高为了在体内验证HBV对miR-155的调控作用,收集C57B/6野生型与HBV转基因小鼠的肝组织,纯化肝实质细胞,分别提取总RNA,qRT-PCR检测miR-155表达。结果表明HBV转基因小鼠肝组织和肝实质细胞内miR-155表达水平均明显高于野生型小鼠(P<0.05,P<0.01),再次证明HBV可以在体内调节肝细胞内miR-155 表达。4.miR-155促进体外肝癌细胞增殖众多文献提示miR-155调节炎症反应,参与肿瘤发生。为探究miR-155对肝癌细胞恶性增殖能力的影响,首先在SMMC7721细胞内过表达miR-155或抑制其表达,通过EdU染色检测EdU阳性染色细胞比例。同样在三种肝癌细胞系Huh7、HepG2、SMMC7721 过表达或抑制 miR-155,Western blot 检测细胞内PCNA表达。结果显示,过表达miR-155的细胞中EdU阳性细胞比例明显升高且细胞内PCNA表达水平升高,而抑制miR-155表达的细胞中EdU阳性细胞比例显著降低且PCNA表达下降,提示miR-155能够促进肝癌细胞的增殖。5.HBV阳性肝癌组织中PCNA和miR-155表达显著高于HBV阴性肝癌组织为进一步在临床标本中验证HBV-miR155在肝癌恶性增殖中的作用,收集临床肝癌组织标本,qRT-PCR检测PCNA及miR-155表达,并比较HBV阳性及HBV阴性肝癌组织中的差异。结果显示,与HBV阴性肝癌患者相比较,HBV阳性患者的肝癌组织中PCNA和miR-155高水平表达比例均明显升高(10/17,59%vs.2/7,29%,χ2=18.26,df=1,P<0.0001),提示HBV阳性肝癌组织中细胞增殖能力较强,并且miR-155在其中高水平表达。五、miR-155通过与ZHX2的3’UTR结合抑制其蛋白表达生物信息学分析显示,ZHX2 3’UTR存在miR-155的种子序列,提示ZHX2是miR-155的靶分子。本研究通过体外实验结合报告基因检测及临床相关性分析,以验证上述假说。1.miR-155显著抑制肝癌细胞系ZHX2蛋白表达利用脂质体转染在Huh7、HepG2、SMMC7721肝癌细胞内高表达或干扰miR-155,48h后收集细胞,Westernblot检测ZHX2表达水平。结果表明,在三种检测肝癌细胞系中,miR-155均可显著抑制ZHX2的蛋白表达。2.miR-155 与 ZHX2 3’UTR 位点结合大量研究证明,microRNA通过与靶基因mRNA 3’UTR种子序列结合促进mRNA降解或者抑制蛋白质翻译从而调控基因的表达。为探究miR-155对ZHX2的调控机制,本研究扩增包含miR-155种子序列、长度为603bp的ZHX2 3’UTR片段,并克隆于载体pGL4-promoterXbaI位点,构建报告基因质粒pGL4-promoter-ZHX2 3’UTR,同时构建miR-155种子序列点突变和缺失突变的两种质粒 pGL4-promoter-ZHX2 3’UTR site mut 和 pGL4-promoter-ZHX2 3’UTR del mut。利用脂质体转染技术,在HeLa细胞内分别共转染ZHX2 3’UTR、两种突变质粒以及miR-155模拟物,48小时后收取细胞蛋白,双荧光素酶体系检测荧光活性。结果显示,miR-155过表达显著抑制ZHX2 3’UTR介导的荧光活性(P<0.01),但对ZHX2 3’UTR点突变和缺失突变质粒介导的荧光活性无显著影响,提示miR-155能够结合于ZHX2 3’UTR的种子序列。体外细胞实验结果提示,miR-155可以与ZHX2 3’UTR种子序列结合从而抑制其蛋白表达。3.ZHX2表达水平与miR-155表达呈现负相关关系前述研究提示miR-155调控ZHX2表达,为进一步验证该结论,收集不同肝癌细胞系(HCCLM3、MHCC97H、BEL-7402、Huh7、SMMC7721、HepG2)及12例HBV阳性患者的癌旁组织,提取总RNA,通过qRT-PCR检测miR-155和ZHX2 mRNA,结果表明不论是在肝癌细胞系还是肝组织中ZHX2表达均与miR-155表达水平负相关。六、HBx通过上调miR-155抑制ZHX2表达综合以上结果表明,HBx可以促进miR-155表达水平,同时miR-155能够抑制ZHX2的表达。为了确定miR-155是HBx调控ZHX2的关键环节,进行如下拯救实验:分别在肝癌细胞系HepG2、SMMC7721细胞中共同转染pcDNA3+microRNA inhibitor control、pcDNA3-HBx+ microRNA inhibitor control、pcDNA3-HBx+miR-155 inhibitor,48h后收集细胞,qRT-PCR和Western blot检测ZHX2表达情况。结果显示,与阴性对照组相比,HBx能够抑制ZHX2的表达,miR-155抑制物则使得HBx对ZHX2的抑制作用消失,提示HBx通过上调miR-155从而抑制ZHX2的表达。结论及意义:综上所述,本研究首次证明HBV尤其是HBx通过原癌microRNA miR-155抑制抑癌基因ZHX2的表达,从而促进肝细胞肝癌发展。本研究发现miR-155被HBx激活高表达,并促进肝癌细胞增殖的作用,并证实ZHX2是miR-155的新的靶基因。本研究提示miR-155水平升高和ZHX2表达降低可能是HBV相关肝细胞肝癌进展的重要因素,为探寻相关治疗方法提供了新的理论基础。