颞下颌关节紊乱病（temporomandibular disorders,TMD）是口颌系统第四大常见疾病,其重症表现形式是颞下颌关节骨关节炎（temporomandibular joint osteoarthritis,TMJOA）。软骨退变是TMJOA早期最典型的病理特征之一,但其确切发病机制尚不清楚。软骨细胞作为软骨内唯一的细胞类型,其异常死亡是TMJOA软骨退变的核心事件。与凋亡和自噬相比,近年来新发现并确认的细胞死亡模式——程序性坏死（necroptosis）的一大特点是其发生后细胞膜破裂并向周围组织释放损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns,DAMPs）,进一步造成周围细胞和基质的损伤,因此程序性坏死的发生对组织稳态的破坏性更大。TNFα-RIPK3-pMLKL-DAMPs扩散是程序性坏死发生的经典通路,大量研究表明TNFα、DAMPs的表达与骨关节炎严重程度正相关,且软骨细胞死亡后所释放的DAMPs有可能在关节内诱导周围细胞分泌TNFα、MMPs、ADAMTSs等因子,进一步加重软骨退变。程序性坏死是不是TMJOA髁突软骨退变中的主要细胞死亡模式,阻断程序性坏死相关进程能否逆转髁突软骨退变,退变髁突软骨中软骨细胞程序性坏死发生后有哪些DAMPs产生,这些DAMPs是否具有进一步加重髁突软骨退变的能力,目前都不得而知。基于此,我们针对TNFα-RIPK3-pMLKL-DAMPs通路可能在TMJOA髁突软骨退变中发挥的作用,开展了以下研究:（一）程序性坏死及其相关因子表达水平与髁突软骨退变之间的相关性研究【方法】通过腹腔内注射过量雌激素（E2）或/和构建单侧前牙反牙合（unilateral anterior crossbite,UAC）的方法建立大鼠髁突软骨TMJOA模型,分别于造模后1周、3周和6周收集颞下颌关节,通过H＆E染色、番红O/固绿染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色评价髁突软骨的退变程度;运用透射电子显微镜观察各组髁突软骨中细胞的超微结构以确定程序性坏死的发生;采用Cleaved-Caspase3/pMLKL免疫荧光和TUNEL双染检测髁突软骨中程序性坏死细胞的分布情况;采用免疫组化染色、免疫荧光染色及western blot等方法检测髁突软骨中程序性坏死相关因子的定位及表达水平。【结果】1.与操作对照组（C组）相比,造模后3周和6周时过量雌激素注射组（E组）、单侧前牙反牙合组（UAC组）和过量雌激素注射+单侧前牙反牙合组（UACE组）髁突软骨厚度显著变薄（P＜0.01）,番红O和COLⅡ阳性面积明显减少（P＜0.05）;与E组相比,造模后3周时,UACE组髁突软骨厚度更薄（P＜0.01）,造模后3周和6周时番红O和COLⅡ阳性面积更少（P＜0.001）;与UAC组相比,造模后3周和6周时,UACE组番红O面积更少（P＜0.001）,这提示联合作用的UACE组的髁突软骨退变程度显著重于单独造模的E组和UAC组。2.透射电镜下,C组软骨细胞呈多角形,含有完整的细胞器和细胞膜;而造模后3周时UACE组软骨内即可见多个细胞的细胞器肿胀,细胞膜破裂等典型的程序性坏死特征。3.与C组相比,造模后3周UACE组中即存在大量TUNEL和pMLKL双阳性但Cleaved Caspase-3阴性的程序性坏死软骨细胞。4.程序性坏死通路相关因子TNFα、RIPK1、RIPK3及pMLKL主要表达在软骨肥大层;与C组相比,造模3周和6周后,E组、UAC组和UACE组髁突软骨中TNFα、RIPK1、RIPK3及pMLKL阳性细胞显著增多,且RIPK1/RIPK3双染阳性细胞亦增多;同时E组、UAC组和UACE组髁突软骨中TNFα、RIPK3及pMLKL蛋白表达水平也显著高于C组（3周时P＜0.01;6周时UACE vs C:P＜0.001）;更重要的是,在软骨退变程度较重的UACE组,pMLKL蛋白的表达水平均显著高于E组和UAC组（P＜0.001）。【结论】腹腔内注射过量雌激素、构建单侧前牙反牙合模型或二者联合应用均可导致大鼠髁突软骨出现OA样退变。在退变髁突软骨中大量软骨细胞发生了典型的程序性坏死。退变髁突软骨中程序性坏死相关因子的表达水平与软骨退变程度正相关,这些结果提示程序性坏死可能在TMJOA髁突软骨退变进程中发挥着重要作用。（二）抑制程序性坏死对髁突软骨退变的影响研究【方法】通过在大鼠颞下颌关节腔局部注射程序性坏死关键因子RIPK3的抑制剂GSK-872（UACE+GSK组）或MLKL的抑制剂NSA（UACE+NSA组）,对髁突软骨退变较严重的UACE组大鼠进行治疗,3周后检测软骨退变程度和程序性坏死相关因子的定位及表达水平。在MLKL基因敲除小鼠和野生型小鼠中分别构建单侧前牙反牙合模型,3周后检测髁突软骨退变程度和软骨细胞死亡情况。【结果】1.与UACE组相比,UACE+GSK和UACE+NSA组软骨厚度、番红O和ColⅡ阳性面积比均显著升高（P＜0.001）。与UACE+GSK组相比,UACE+NSA组软骨番红O和ColⅡ阳性面积比更高（P＜0.01）。与UACE组相比,UACE+GSK和UACE+NSA组TNFα、RIPK3、pMLKL阳性细胞数量和蛋白表达水平均降低（UACE+GSK vs UE:P＜0.01;UACE+NSA vs UE:TNFα,P＜0.01）,并且降解因子ADAMTS5和MMP13表达水平也显著降低（P＜0.05）,而ACAN表达水平升高（P＜0.01）。2.在单侧前牙反牙合模型刺激下,MLKL基因敲除小鼠髁突软骨中的TUNEL阳性细胞（死亡细胞）数量显著少于野生型小鼠,髁突软骨厚度和番红O阳性面积百分比均显著大于野生型小鼠（P＜0.01）。【结论】体内通过特异性药物阻断程序性坏死关键因子RIPK3或MLKL,基因敲除MLKL,均能显著抑制髁突软骨细胞死亡的发生,并逆转髁突软骨的退变进程。程序性坏死是TMJOA退变软骨中的主要细胞死亡模式。（三）TNFα-RIPK3/pMLKL-DAMPs-TNFα恶性环路在髁突软骨退变中的作用机制研究【方法】根据王晓东等（Cell,2012）报道的方法,通过TNF-α、SM-164和Z-VAD-FMK联合刺激（TSZ组）构建髁突软骨细胞程序性坏死模型。运用CCK-8检测、LDH检测、光镜观察确定细胞死亡时间;采用透射电子显微镜观察、pMLKL免疫荧光和TUNEL双染、RIPK1/RIPK3免疫荧光双染确定细胞死亡类型。通过慢病毒转染siRNA下调RIPK3或MLKL表达水平,然后评价TSZ刺激下各组细胞死亡的发生和程序性坏死相关因子的表达。收集Con组和TSZ组细胞上清,运用定量蛋白质组学分析差异蛋白。通过查阅文献初步筛选出可能的DAMPs分子,之后应用ELISA进行验证。然后通过筛选出的特异性DAMPs直接作用于软骨细胞,或在TSZ作用下应用抗体中和特异性DAMPs分子,检测炎性/降解因子的表达,从而探索髁突软骨细胞程序性坏死所释放的特异性DAMPs进一步加重软骨退变的可能性。【结果】1.TSZ刺激髁突软骨细胞8小时后细胞活力显著降低（P＜0.001）,乳酸脱氢酶释放率显著升高（P＜0.001）,并且出现大量变小变圆变亮的死亡细胞。透射电镜观察,Con组软骨细胞具有完整的细胞器和细胞膜,而TSZ组软骨细胞出现细胞器肿胀、细胞膜破裂等变化。与Con组相比,TSZ组TUNEL和pMLKL双染阳性细胞及RIPK1/RIPK3双染阳性细胞均明显增多,这提示TSZ刺激下髁突软骨细胞发生了典型的程序性坏死。2.转染RIPK3或MLKL siRNA后,髁突软骨细胞中的RIPK3或MLKL的基因和蛋白表达均显著降低（P＜0.001）;体外敲低RIPK3或MLKL,能够显著减少TSZ刺激所导致的细胞死亡,且在TSZ作用下软骨细胞中ADAMTS5、COLⅡ和ACAN的基因表达无显著性变化（P＞0.05）,这提示体外敲低RIPK3或MLKL可以阻断TSZ刺激所导致的髁突软骨细胞程序性坏死。3.Con组和TSZ组髁突软骨细胞上清的定量蛋白质组学共分析到1081种蛋白,与Con组细胞上清相比,TSZ组细胞上清中135种蛋白表达显著升高（P＜0.05）,9种蛋白表达显著下降（P＜0.05）。ELISA检测结果显示,与Con组细胞上清相比,在TSZ组细胞上清中SDC4、HSP90、S100A13和CSPG4表达显著升高（P＜0.01）,这提示SDC4、HSP90、S100A13和CSPG4可能是髁突软骨细胞程序性坏死发生后所释放的关键DAMPs。4.SDC4蛋白直接作用于髁突软骨细胞后,出现大量变小变圆变亮的死亡细胞;而在髁突软骨细胞培养体系中加入SDC4抗体中和SDC4后,TSZ作用下细胞死亡数量显著减少。与Con组相比,SDC4作用后,细胞中ACAN显著减少（P＜0.01）,TNFα、ADAMTS5、RIPK3和pMLKL显著升高（P＜0.05）;上清中TNFα、ADAMTS5和MMP13显著升高（P＜0.01）。通过SDC4抗体中和SDC4,能够抑制TSZ作用下髁突软骨细胞中ACAN的减少及TNFα、ADAMTS5、MMP13和pMLKL的升高;同时抑制TSZ作用下上清中TNFα、ADAMTS5和MMP13的升高。这提示SDC4可以作为独立的因素导致髁突软骨细胞死亡并合成炎性/降解因子。【结论】TSZ刺激可导致髁突软骨细胞发生RIPK3/MLKL依赖性程序性坏死。髁突软骨细胞发生程序性坏死后可以释放出SDC4、HSP90、S100A13和CSPG4等特异性DAMPs。SDC4等DAMPs可以作为独立的因素刺激软骨细胞合成与软骨退变密切相关的炎性/降解因子。【全文结论】在TMJOA病变早期,TNFα-RIPK3/pMLKL-DAMPs-TNFα恶性环路能够不断促进软骨细胞死亡和基质降解,进而加重髁突软骨退变。