丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)为有包膜的单股正链RNA病毒,是引起人类肝病的重要致病因子。目前全球HCV感染者约1.2到1.7亿,其中发病率以非洲最高,欧美等国家较低。HCV主要经血液传播,引起肝炎、肝脂肪变性、肝硬化以及肝癌等肝脏疾病,并与糖尿病、淋巴瘤等肝外疾病高度相关。慢性感染是HCV感染致病的重要特征,HCV感染者在感染初期大多无明显症状,约80%感染者发展为慢性感染时才表现出肝病临床症状。HCV慢性感染是欧美、日本等发达国家肝硬化、肝癌等终末期肝病的主要致病因素。自1989年被发现以来,HCV的分子生物学与感染、致病机制以及药物与疫苗研究受到全球关注,HCV复制子(HCVreplicon)与细胞培养来源的HCV(cell culture derived HCV,HCVcc)模型的建立是HCV研究历史上的重要里程碑,成为该研究领域的有力推手。基于HCV细胞感染模型的研究为开发抗HCV药物提供了重要工具,近年来上市的新一代直接抗HCV药物(DAAs)使得丙型肝炎成为可治愈的疾病。彻底消除丙型肝炎仍有赖于有效疫苗的上市应用,丙肝疫苗的研发与艾滋病疫苗存在相似的困境,尽管一系列不同类型的丙肝疫苗处在研发过程中,但是其中部分疫苗已经终止了研发进程。目前没有一种疫苗显示出良好的应用前景。由于RNA聚合酶在指导HCV基因组复制过程中乏校对机制,导致HCV基因组的高度异质性,因而HCV在感染者体内以准种或类似株(quasispecies)形式存在。根据基因组的异质性,HCV被分为7个不同基因型,每个基因型又包含数十个不同的亚型。HCV基因组的高度变异是其感染后高发慢性化感染的重要原因之一,也是HCV疫苗研发面临的最大障碍。我国属于HCV中等流行区,HCV感染者有3000-4000万人,基因型呈现典型的区域分布特征,以1b和2a型为主,但珠三角和西南地区则以3型和6型更为常见。HCV包膜蛋白由E1、E2两个糖蛋白形成的异源二聚体组成,介导HCV的细胞侵入过程,E1、E2均为高度糖基化的蛋白,其中E2蛋白的功能研究的比较清楚,该蛋白是介导HCV与肝细胞表面多个受体序贯作用,引发细胞膜内吞的主要蛋白。在HCV感染者血清中可检测到针对各基因型的交叉中和抗体,这些抗体主要针对的靶标是E2蛋白。病毒被内吞入胞以后,病毒包膜与内吞小体膜的融合可能由E1蛋白引发,但总体上对E1蛋白的功能还有待进一步深入研究。针对E1蛋白的中和抗体较少有报道。目前还不能直接从感染者血清中直接分离、培养HCV,HCVcc是目前在细胞层面研究HCV感染机制的最天然模型,HCVcc入侵宿主细胞的方式、感染特性、病毒的生命周期等方面与感染者血清中的HCV颗粒高度相似。HCVcc颗粒性状与感染者血清中的HCV颗粒均结合有大量的脂蛋白,与脂蛋白的结合一方面有助于病毒颗粒与肝细胞表面的肝素、低密度脂蛋白受体等捕获分子结合从而有助于病毒在肝细胞表面的富集;另一方面,脂蛋白能隐藏HCV包膜蛋白种的中和表位,从而有利于HCV逃避体液免疫应答。被研究者广泛使用的HCVcc均含有2a型JFH-1株的非结构基因,不同型/株结构基因与JFH-1株置换重组可得到感染性高低不同的HCVcc。将转录得到的HCV基因组RNA转染人肝癌细胞系Huh7或Huh7衍生的Huh7.5.1细胞,HCVcc即可产生并释放到细胞培养上清中。在我们前期实验中发现,以电穿孔方式转染HCV基因组RNA制备的原代J6/JFH1嵌合HCVcc对HCV感染者血清的中和抗体敏感性与连续传代制备的HCVcc有明显差异。基于该现象,本研究探究了 HCVcc在连续传代培养过程中包膜蛋白出现的适应性突变对病毒感染特性的影响。另一方面,本研究对一起聚集性HCV感染人群血清样本的病毒中和活性进行检测,并对病毒中和活性与病毒载量之间的相关性进行分析。第一部分HCV包膜蛋白突变对其功能的影响HCV包膜蛋白是暴露在病毒颗粒表面的结构蛋白,在病毒的感染和免疫逃逸中发挥重要作用。本研究通过对传代制备的病毒进行深度测序后发现,包膜蛋白中存在F291V、T331S、T444P突变。F291V突变位于E1蛋白中,T331S和T444P突变位于E2蛋白中。于是分别在原型质粒中引入这些突变,并制备相应含这些突变的HCVcc:含F291V、T331S、T444P突变的E41/JFH1株;含T444P突变的D42/JFH1株以及含F291V突变的B43/JFH株,以期研究包膜蛋白突变对病毒功能的影响。结果发现包膜蛋白突变使HCVcc滴度上升10-15倍,而且各突变不影响病毒E2蛋白表达及病毒入侵宿主细胞的速率。但突变在增加病毒包装和释放效率的同时,使病毒表面结合的脂蛋白含量增加,病毒滴度增加,密度降低,对SR-BI受体和脂蛋白信号通路的利用度加大。在没有中和抗体筛选和宿主免疫系统的进化压力下,病毒的复制包装释放效率都在不断的提高,病毒朝着高滴度的方向进化。体现了病毒进化上在功能和环境的自然统一。第二部分包膜蛋白突变对HCV抗体中和活性的影响用2a型HCV患者血清对E41/JFH1株和J6/JFH1株病毒进行中和实验,结果发现,HCV患者血清能够明显中和E41/JFH1株突变病毒的感染,而较难中和J6/JFH1株病毒感染。APOE抗体在1:50稀释时能中和76%的E41/JFH1株病毒感染,而对J6/JFH1株感染则只中和55%;用HCV包膜蛋白E2的77-661,3A,5A抗体及HVR1的抗体TW-SHC对E41/JFH1株病毒和J6/JFH1株病毒进行中和实验。结果发现:这些抗体均能有效的中和E41/JFH1突变病毒的感染,中和活性分别70%,75%,65%和60%,而J6/JFH1株则难以被中和。说明这些抗体对E41/JFH1突变株病毒有交叉中和活性,包膜蛋白突变并没有影响病毒的中和表位。用 77-661,TW-SHC,APOE 及 CD81 抗体对 E41/JFH1 和 J6/JFH1 高/低密度病毒进行中和,结果发现77-661抗体,对E41/JFH1和J6/JFH1高/低密度病毒中和效率分别为76%和42%与56%和24%,说明77-661抗体作为包膜蛋白E2的抗体能够更加有效的中和高密度病毒的感染;而TW-SHC抗体对E41/JFH1和J6/JFH高/低密度病毒中和效率分别为65%和10%与86%和29%,说明TW-SHC抗体较难中和高密度J6/JFH1病毒,而对E41/JFH1株低密度病毒中和作用较好;APOE抗体对E41/JFH1和J6/JFH1高/低密度病毒中和效率分别为45%和23%与88%和37%,说明包膜蛋白突变增加了 APOE抗体对突变病毒的中和活性。而CD81抗体则对E41/JFH1和J6/JFH1高/低密度病毒中均有较好的中和活性,说明突变不改变病毒对CD81受体的利用,不同密度的颗粒对CD81受体的利用也无明显的差异性。包膜蛋白的突变改变了病毒对受体利用及中和抗体活性,这体现了 HCV在进化和功能上的统一,病毒以适度降低其感染性为代价,逃避宿主的中和抗体,但却保证了病毒的持续感染,体现了病毒自然选择的特点。同时本研究还鉴定出HCV包膜蛋白中有利于病毒免疫逃逸的氨基酸残基,对研究病毒的进化和免疫逃逸具有重要的意义。第三部分聚集性HCV感染者血清中HCV中和抗体与病毒载量的相关性分析本部分实验通过对云南某一地区聚集性HCV感染的血清样本进行分析,发现HCVRNA拷贝大于≥ 1×106的组别中,ALT和AST的数值呈现了降低的趋势;通过对患者体内中和抗体和HCV E2抗体的研究发现中和抗体不能有效抑制慢性HCV患者体内病毒的复制,中和抗体在慢性化感染中并不起保护作用。本研究探究了 HCV在家庭成员间传播的风险,并分析感染者肝功能,中和抗体水平与血清中病毒载量的关系。证实慢性HCV患者血清中高滴度的中和抗体并不能对患者起到保护作用。小结:本研究通过探究HCV包膜蛋白在传代过程中产生的适应性突变对病毒感染特性、抗体中和活性、受体利用度的影响和一例聚集性HCV感染者血清学特性分析,加深了对HCV包膜蛋白致病机制和病毒免疫逃逸的理解。