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神经母细胞瘤是一种极为常见的儿童实体瘤,具有高度可变预后性,并且其占儿童肿瘤的6%-10%的发生率以及接近儿童因患癌症死亡的15%。在组织学方面,神经母细胞瘤从良性交感神经元到肿瘤形成过程中具有高度异质性,且由于其具有较强的侵袭和转移能力而容易引起患者死亡。尽管早期肿瘤预后性良好,晚期肿瘤对包括手术,化疗以及放射性治疗在内的传统治疗手段有很强的抗性,且这些方法都有对应的局限性:传统的手术治疗具有创伤性大,治愈率低,易转移等局限;放射性治疗则会容易导致患者恶心呕吐、患者机体白细胞减少以及免疫力低下等毒副病症。因此,研究新一代毒性较低、肿瘤特异性强的抗肿瘤药物是非常迫切的,对一些抗肿瘤药物的基础研究可肿瘤临床治疗提供一定的理论基础。替加环素,结构和功能上与四环素相似,是米诺环素的新一代衍生物,并在在2005年被美国FDA批准为临床抗菌药物,其对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌以及耐药性极强的病原菌具有广谱抗菌性。越来越多的研究表明四环素,以及多西环素,米诺环素等其衍生物具有抗肿瘤活性。已有研究表明替加环素能够在恶性血液肿瘤以及胃癌细胞中有明显抑制细胞增殖的作用,提示这一类抗生素可以作为广谱抗肿瘤的新药。目前,替加环素的抗癌作用报道甚少,研究缺乏系统性,并且其抗癌机制尚不明确,缺乏切实可靠的理论依据,限制了其临床抗癌方面的应用。本课题旨在揭示替加环素作作为潜在的治疗神经母细胞瘤的有效药物提供一定程度的理论基础。主要结果如下:1、替加环素能够抑制神经母细胞瘤细胞的增殖和生长以两种神经母细胞瘤细胞系BE2C以及SK-N-AS为实验细胞,观察细胞形态以及细胞数量,MTT方法检测不同浓度替加环素对BE2C以及SK-N-AS两种细胞系的细胞生存率的影响,实验结果显示1OμM以及10OμM tigecycline处理两种细胞系后,与DMSO处理的对照组相比,神经母细胞瘤细胞细胞的数量显著减少,表明替加环素能够抑制肿瘤细胞的生长;通过BrdU实验方法检测替加环素对神经母细胞瘤细胞增殖能力的影响,实验结果显示BrdU阳性率明显降低,表明肿瘤细胞的增殖受到抑制。2、替加环素对神经母细胞瘤细胞周期的影响及其机制通过PI染色对BE2C以及SK-N-AS两种细胞周期的检测显示:与对照组相比,lOμM替加环素处理肿瘤细胞48h,细胞周期阻滞于G1期。利用Western Blot检测了与细胞周期G1期相关的调控蛋白CCND1、CCNE1、CDKs类的蛋白表达水平,结果显示与对照组相比,lOμMtigecycline处理肿瘤细胞48h后,能够显著下调CCND1、CCNE1的表达。由于在神经母细胞瘤细胞中,Akt的磷酸化水平与其细胞周期调控密切相关,因此,我们检测了 Akt磷酸化水平,研究结果显示替加环素通过下调Akt的磷酸化水平以及其下游FOX03a的磷酸化水平来调控细胞周期。为了进一步验证,我们使用了Akt特异性激活剂IGF-1,PI染色检测显示,在用替加环素处理肿瘤细胞后,再使用IGF-1,能够有效激活Akt磷酸化水平,并且能够解除替加环素对细胞周期的抑制。3、替加环素对抑制肿瘤细胞的成瘤能力的影响通过soft agar软琼脂实验检测替加环素对肿瘤细胞的自我更新能力的影响,结果显示,与使用DMSO处理的对照组相比,10μM替加环素处理的实验组的克隆数目显著减少,且克隆形状也显著变小,该研究表明替加环素使得肿瘤细胞的自我更新能力受到抑制。建立荷瘤鼠腹腔BE2C细胞移植模型,分为DMSO对照组和替加环素给药组,期间观察动物一般生命体征的变化以及肿瘤体积的变化。实验显示,与注射等体积的DMSO的对照组相比,实验组中荷瘤鼠体重无明显改变,无明显呕吐等症状以及精神异常,且实验组肿瘤生长缓慢,体积减小,说明替加环素能够明显抑制神经母细胞瘤细胞的自我更新能力以及成瘤能力。