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目前全球约有2.57亿人感染乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）,并引发慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B,CHB）,每年导致约100万人死于HBV相关肝病,严重危害人类健康。CHB临床治疗手段有限,每年仅有少于1%的患者被治愈。因此,开发新型HBV干预策略仍是全球医学领域的研究热点。肝脏作为HBV感染的唯一宿主器官,通过肠-肝轴与肠道间有密切的相互作用。诸多研究表明,多种肝脏疾病,包括CHB、代谢相关脂肪性肝病（Metabolic associated fatty liver disease,MAFLD）、肝硬化及肝癌,通常伴随着肠道菌群失衡;相应地,紊乱的肠道菌群则会进一步加重肝病进展。肠道菌群不仅影响肠道免疫稳态,而且调控机体免疫。通过粪便菌群移植（Fecal microbiota transplantation,FMT）、益生菌或菌群代谢产物干预失调的肠道菌群已成为新的治疗方向。近期临床实验报道FMT诱导长期抗病毒治疗无效CHB患者的血清HBeAg清除,提示干预肠道菌群在HBV清除及慢乙肝治疗中的潜在价值。益生菌作为常用的肠道菌群调节剂,简便、安全,被广为应用。但益生菌是否具有促进HBV清除、治疗乙肝的作用尚未见报道。本研究借助HBV小鼠模型,探讨益生菌在HBV清除中的作用及相关机制,旨在为CHB干预提供新策略。论文分为以下三个部分:第一部分益生菌促进HBV清除的作用及机制研究1.益生菌通过调节肠道菌群促进模型小鼠清除HBV首先,选用两种不同的益生菌,Berium,Lactobacillus,Enterococcus)和 EcSN（Escherichia coli Nissle1917）,分别在 HBV 造模之前（BLEPre 和 EcSNPre）或同时（BLE）进行灌胃处理。通过检测HBV相关指标发现,两种益生菌处理均显著促进小鼠清除HBV。提前补充益生菌并未展现更强的抗HBV效果,故后续研究采用同时灌胃BLE作为常规干预手段。进一步16S rRNA测序结果显示,补充益生菌显著改变小鼠粪便微生物群落组成,丰富菌群物种多样性,并富集多种有益菌。进一步FMT实验发现BLE小鼠的粪便菌群同样促进受体小鼠体内HBV的清除。表明益生菌通过调节小鼠肠道菌群显著加速HBV清除。2.益生菌改善肠道屏障功能及免疫稳态FITC-葡聚糖实验及血清iFABP水平检测结果显示,补充益生菌显著改善小鼠肠道屏障通透性;相一致地,BLE小鼠肠道组织中多种紧密连接蛋白（Occludin、Claudin-1和Tjp1）mRNA表达水平显著升高。此外,补充益生菌显著上调小肠固有层、派尔淋巴结及肠系膜淋巴结中IL-17A、IL-22及IL-21的表达,提示益生菌明显改善肠道免疫稳态。3.益生菌介导的HBV清除依赖CD4+T细胞及其分泌的IFN-γ和IL-21接下来,通过抗体清除实验明确在益生菌诱导HBV清除过程中发挥关键作用的免疫细胞亚群。结果显示,清除CD8+T、γδT和NK细胞仅部分影响益生菌的抗HBV效果,而清除CD4+T细胞几乎完全逆转了益生菌的抗HBV效果。同样,FCM结果显示,补充益生菌后小鼠脾脏和肝脏中CD44hiCD62Llow效应CD4+T细胞的比例,及CD4+T细胞表达IL-21和IFN-γ的比例均显著增加。同时,BLE小鼠肝匀浆中检测到更高水平的IL-21和IFN-γ。文献证实CD11ahiCD49d+T细胞是宿主体内能识别病毒抗原的特异性免疫细胞。FCM结果同样显示,BLE小鼠肝脏和脾脏中CD11ahiCD49d+CD4+T细胞和 CD 11 ahiCD49d+CD8+T（CD 11ahiD49d+CD3+CD4-T）细胞的比例及功能均显著增加。进一步抗体阻断实验结果发现,阻断IL-21R或IFN-γ均能显著逆转益生菌诱导的HBV清除。表明益生菌介导的HBV清除依赖CD4+T细胞及其分泌的IFN-γ和IL-21。第二部分代谢产物亚精胺促进HBV清除的作用及机制研究1.代谢产物亚精胺促进HBV清除为明确益生菌介导HBV清除中发挥关键作用的代谢产物,收集小鼠粪便进行非靶标代谢组学检测。共发现38种差异代谢产物,其中BLE小鼠中富集程度最显著的代谢产物包括低聚糖、氨基酸及其衍生物和多胺。进一步靶标多胺代谢组学检测发现,BLE小鼠肝脏中亚精胺（Spermidine,SPD）显著富集。为明确SPD在HBV清除中的作用,给予HBV模型小鼠3mM亚精胺水,以普通饮水作为对照组。结果显示,与益生菌作用相似,SPD显著降低小鼠血清HBsAg、HBVDNA及肝组织pgRNA的水平。且SPD同样增强肠道屏障功能并改善肠道免疫稳态。2.亚精胺通过自噬增强CD4+T细胞效应功能FCM结果显示,与益生菌作用相似,SPD明显增强CD4+T细胞和病毒特异性T细胞免疫应答。SPD 是目前已知诱导 eIF5A（Eukaryotic translation initiation factor 5A）羟腐胺修饰活化的唯一底物,该修饰在诱导自噬及免疫调节中发挥重要作用。为研究自噬通路是否参与SPD增强CD4+T细胞功能,利用不同浓度SPD处理OVA323-339刺激的OTⅡ-T细胞。FCM结果显示,与预期相符,SPD以剂量依赖性方式诱导CD4+T细胞中的自噬小体积累和IFN-y表达。进一步利用自噬抑制剂3-MA及羟腐胺修饰的特异性抑制剂GC7分别处理SPD刺激的OTⅡ-T细胞。结果显示,GC7和3-MA均显著抑制CD4+T细胞中SPD诱导的IFN-γ积累。此外,借助HBV抗原肽体外扩增HBV特异性T细胞,结果同样显示,SPD增加了 HBV抗原肽诱导的病毒特异性CD4+T细胞中IFN-γ表达,而GC7和3-MA处理显著抑制上述作用。表明SPD可通过自噬途径增强CD4+T细胞的功能。第三部分 益生菌或亚精胺与恩替卡韦联合治疗促进HBV清除恩替卡韦（Entecavir,ETV）是目前临床上应用最广泛的抗HBV药物之一,但是其很少能实现血清HBsAg的清除,且副作用强。为探讨益生菌和亚精胺在HBV治疗中的潜在应用价值,对HBV模型鼠进行益生菌或亚精胺与ETV的联合用药。结果显示,与ETV单独治疗组相比,益生菌（ETV+BLE）和亚精胺（ETV+SPD）联合治疗均显著降低小鼠血清HBV DNA和HBsAg水平。FCM及qPCR结果显示,与ETV单独治疗组相比,联合治疗组抗HBV免疫应答增强。提示益生菌和亚精胺联合ETV可增强宿主抑制HBV的效果,提升ETV在CHB临床治疗中的潜在价值。研究意义本研究首次证实了益生菌和代谢产物亚精胺促进小鼠清除HBV的作用,并揭示了菌群/亚精胺-CD4+T细胞-IL-21/IFN-y在HBV清除中的新机制。我们的研究不仅为阐明肠道菌群介导HBV清除的免疫机制提供新数据,而且为临床治疗慢乙肝提供了新思路。