背景：胃癌已成为当今世界上发病率最高的肿瘤之一,在我国其发病率高于其他国家。目前认为,胃癌的发生和发展是在外环境与内基因共同作用下的一系列基因参与的复杂过程。一些原癌基因、抑癌基因、转录因子、生长因子等在其中不同程度地起了重要作用,这些分子可作用于肿瘤生长信号通路的复杂网络结构,从而逐步促进肿瘤发生。同时这些分子的功能也受到包括miRNA (micro-ribonucleic acids,微小RNA)在内的其他分子的调节,共同发挥调控肿瘤生物学行为的作用。miRNA是一组长度在21-23个核苷酸之间的单链非编码RNA。 miRNA被认为能与mRNA (messenger RNA,信使RNA结合),并通过抑制蛋白翻译来阻止表达。在哺乳动物中,miRNA结合在在靶mRNA的3’-UTR区(3’untranslated regions,3’端非翻译区),通过不完全互补配对的方式来诱导靶nRNA降解从而抑制蛋白表达,发挥基因表达的调控作用。在胃癌中异常表达的miRNA通过对其靶基因的作用,广泛调控着肿瘤的细胞增殖、凋亡、侵袭与转移等各个方面,但其确切的调控分子学机制复杂,目前并不十分清楚。核转录因子Sp1属于核心转录因子之一,是一个富含锌指结构的DNA结合蛋白。Sp1可以调节许多蛋白的表达情况,如PP2A (protein phosphatase2A,磷酸酶2A),VEGF (vascular endothelial growth factor,血管内皮生长因子), CyclinD1(细胞周期蛋白D1)和MMP (matrix metalloproteinases,基质金属蛋白酶)。因此它能调控包括细胞周期进程、血管生成、细胞迁移和侵袭在内的诸多生理功能,并通过上述这些机制参与肿瘤的发生发展。鉴于Sp1在胃癌发生发展中可能的重要作用,我们推测在胃癌异常表达的miRNA中,可能有一些是通过靶向Sp1而发挥其调控肿瘤生物学行为效应的。目的：检测胃癌组织及细胞株中部分miRNA (miR-145, miR-133a和niR-133b)的表达情况,探讨miR-145, miR-133a和miR-133b对胃癌的生物学行为的影响及其调控作用的分子机制。方法：1.运用Real-time PCR法分析miR-145, miR-133a和miR-133b在胃癌组织及三种胃癌细胞株(SGC7901, MKN45,BCG823)中的表达情况。2.CCK8法检测miR-145, miR-133a和miR-133b对胃癌细胞增殖的影响。3. Transwell迁移及侵袭实验检测miR-145, miR-133a和miR-133b对胃癌细胞迁移及侵袭的影响。4.流式细胞术检测miR-145, miR-133a和miR-133b对胃癌细胞周期变化的影响。5.荧光素酶实验验证Spl是否为miR-145, miR-133a和miR-133b靶基因。6.用免疫印迹(Western blot)及免疫荧光两种方法分别检测Spl在胃癌细胞株SGC7901, MKN45,BCG823中的表达情况。7.用小干扰RNA (siRNA)来检测Spl被敲降后对MMP-9和Cyclin D1表达的影响。8.免疫印迹法检测Sp1, MMP-9和Cyclin D1的蛋白表达水平。结果：1. miR-145, miR-133a和miR-133b在26对胃癌组织标本中表达显著低于正常胃粘膜组织,同样这些miRNA在三种胃癌细胞株SGC7901, MKN45, BCG823中的表达情况均低于正常胃粘膜细胞株GES-1。2.将miR-145, miR-133a和miR-133b模拟物分别转染至胃癌细胞株SGC-7901,BCG-823和MKN-45中,24,48,72小时后三种胃癌细胞株的吸光值明显低于转染阴性对照组,提示其增殖能力受到抑制。3.转染miR-145, miR-133a和miR-133b后,三种胃癌细胞(SGC-7901, BCG-823和MKN-45)穿过Trasnwell小室的细胞数明显少于转染阴性对照组,说明miR-145, miR-133a和miR-133b可抑制胃癌细胞株SGC7901, MKN45, BCG823的迁移及侵袭能力。4.流式细胞术显示过表达miR-145, miR-133a和miR-133b后,胃癌细胞的G1期被阻滞,细胞周期中S期细胞减少。5.瞬时转染的miR-145, miR-133a和miR-133b可使胃癌细胞株SGC-7901、BCG-823、MKN-45中Sp1蛋白表达受到抑制。转染miR-145, miR-133a和miR-133b模拟物及Spl-3’-UTR-Wt(野生型)的细胞中,荧光素酶活性显著低于对照组,这一现象在Spl-3’-UTR结合位点突变时消失,表明Sp1是miR-145,miR-133a和miR-133b的共同靶基因。6.Sp1免疫荧光强度与蛋白表达水平在胃癌细胞株SGC7901, MKN45, BCG823中均明显高于正常细胞株,提示Sp1在胃癌细胞中过表达。7.敲降Sp1后胃癌细胞株中MMP-9与Cyclin D1的表达下调,同样,转染miR-145, miR-133a,miR-133b模拟物后,胃癌细胞中MMP-9及Cyclin D1表达水平也下降。结论：miR-145, miR-133a和miR-133b在胃癌组织与胃癌细胞株SGC7901,MKN45, BCG823中低表达。上调miR-145, miR-133a和miR-133b可以抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并阻止细胞周期进程。Sp1是这些miRNA的靶基因,miR-145, miR-133a和miR-133b通过抑制Sp1及其下游分子Cyclin D1和MMP-9的表达抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。背景和目的：肺癌已成为全世界肿瘤相关死亡的首位原因。与手术、放疗一样,化疗是治疗肺癌的重要手段之一。然而,化疗耐药的产生常常导致了治疗的失败。耐药包括原发性耐药和获得性耐药,临床中常见的多属获得性耐药。最近研究人员发现,表观遗传学水平的变化,如CpG岛异常甲基化、组蛋白修饰、微小RNA(micro ribonucleic acid,miRNA)的异常表达等,是影响细胞耐药性的重要因素。表观遗传学变化不涉及基因水平的改变,因而可能在肿瘤细胞的获得性耐药过程中发挥着更重要的作用。其中,miRNA,一组进化保守的单链非编码RNA,作为近年来生命科学领域研究的热门分子,对肿瘤的获得性耐药起着重要作用。通过在转录后水平对基因表达的调节,miRNA广泛参与了各种生命活动过程,包括细胞分化、增殖和转移等。miRNA异常表达所介导的肿瘤耐药已经在乳腺癌、结肠癌、胃癌、多形性胶质母细胞瘤等多种肿瘤中被报道。其中,有关miR-503的研究也在逐步涌现。比如,在甲状旁腺癌、视网膜母细胞瘤和肾上腺皮质癌中,miR-503被发现表达上调,而在口腔癌细胞和肝细胞癌细胞中,miR-503表达则下调。体外实验发现miR-503可诱导肝癌细胞G1期阻滞并抑制其迁移和侵袭。此外,miR-503可通过调节CUGBP1(CUG-binding protein1CUG连接蛋白1)增加肠上皮细胞对凋亡的敏感性；它还可抑制细胞周期蛋白D1的表达。这些都表明miR-503可能是一个潜在的肿瘤抑制基因,并可能参与了对肿瘤耐药的调节。遗憾的是目前对于miR-503在肺癌细胞耐药机制上的作用我们还知道的很少,因此本研究旨在证实miR-503与肺癌耐药之间的关系并探讨其潜在分子机制。方法：1.用Real-time PCR法分析miR-503在肺癌耐顺铂细胞株A549/CDDP与其亲本细胞株之间的表达差异。2.通过MTT法体外药物敏感性实验检测miR-503对肺癌细胞耐药表型的变化。3.用荧光素酶实验验证BCL2是否为miR-503靶基因。4.用免疫印迹法检测BCL2的蛋白表达水平。5.流式细胞术检测凋亡水平。结果：1.肺癌耐顺铂细胞株A549/CDDP中miR-503的表达水平显著低于其亲本细胞株A549。2.上调miR-503表达可增加肺癌耐顺铂细胞对顺铂的敏感性,而下调miR-503表达可降低肺癌耐顺铂细胞对顺铂的敏感性。3.生物信息学软件预测抗凋亡蛋白BCL2可能是miR-503的靶基因,荧光素酶实验验证了这一假定。4.BCL2的蛋白表达在肺癌耐顺铂细胞中显著高于亲本细胞。5.miR-503通过靶向抑制抗凋亡蛋白BCL2增加了肺癌耐药细胞A549/CDDP对顺铂诱导凋亡的敏感性。结论：miR-503在肺癌耐顺铂细胞株A549/CDDP中高表达,并通过抑制抗凋亡蛋白BCL2介导肺癌细胞对顺铂的耐药。