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目的:
通过表皮生长因子(EGFR)抑制剂—吉非替尼(易瑞沙)作用人肺腺癌A549细胞系构建耐药细胞A549/I,观察耐药细胞A549/I与亲代A549细胞的形态学改变及凋亡及凋亡相关基因及蛋白表达的变化,探讨其耐药机制。
方法:
(1)通过MTT实验检测Gefitinib对A549细胞的IC50,计算RI值。
(2)以IC50为基础采用Gefitinib浓度梯度法作用人肺腺癌A549细胞直至耐药细胞株A549/I建立。以耐药前亲代A549细胞株形态学作为对照,采用倒置相差显微镜观察耐药前A549细胞及耐药后A549/I细胞的形态学特点。
(3)同时运用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率,对比观察耐药前后细胞的凋亡情况。
(4)采用RT-PCR及蛋白印记分析法(western-blot),检测Gefitinib作用人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞后凋亡相关基因和蛋白的表达,分析之间可能存在的关系。
结果:
(1)MTT法测的半数抑制浓度IC50值为0.03umol/ml,A549/I细胞的耐药性稳定。耐药指数(RI)为8.65。
(2)流式细胞仪检测结果显示,与对照组细胞相比,A549/I细胞的凋亡率无明显差异。
(3)倒置相差显微镜观察亲代A549细胞呈长梭型、胞浆丰富、核仁明显。相A549/I细胞呈短缩型,体积较亲代细胞大稍,形状较规则,边界清晰,胞浆丰富,核透亮。
(4)流式细胞仪检测结果显示,经Gefitinib作用的 A549/I细胞有一定的凋亡表现,但与对照细胞相比,凋亡率差别不明显,且不随药物浓度的增加而增加。
(5)RT-PCR及蛋白印记分析法(western-blot)结果显示A549/I组中促凋亡基因P53和Bax的mRNA及蛋白表达低于对照组,A549/I组中抑凋亡基因Bcl-2的mRNA及蛋白表达高于对照组。
结论:
吉非替尼能抑制NSCLC细胞的生长并促进其凋亡抑制细胞的恶性转化,但在药物反复持续作用下细胞会产生抗药性,此耐药性的发生可能与A549/I细胞中促凋亡基因及蛋白P53和Bax的低表达与抑凋亡基因及蛋白Bcl-2的高表达有关。