结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是常见的消化系统恶性肿瘤之一。根据美国癌症协会发布的2021年的癌症数据来看,无论是男性还是女性,结直肠癌的预计发病率与死亡率均排在第三位,达到了8%-9%。而在中国,结直肠癌的发病率和死亡率更高,分别达到了10.2%和9.2%。尽管随着医学技术的提升,结直肠癌的早期诊断和治疗方法都有了很大的提升,但对于中晚期结直肠癌的治疗手段还是以手术切除、化疗为主,由于个体差异,患者的预后各不相同。虽然已经研发了很多分子靶向药物应用于临床,并且达到了一定的治疗效果,但结直肠癌的死亡率仍高居不下,因此研究结直肠癌发生发展的分子机制,从中寻找新的关键分子和治疗靶点,积极改善患者预后和生活质量十分必要。焦亡是Gasdermins（GSDMs）家族介导的一种程序性的炎症性的细胞死亡方式,焦亡发生时,Gasdermins家族的蛋白发生剪切,氨基端聚集到膜上打孔,细胞膜的完整性被破坏,胞浆中的酶、细胞因子等释放到胞外,引起周围的炎症反应。目前研究发现它与很多肿瘤的发生发展相关。而肠道的炎症又是结直肠癌发生发展的重要因素,因此探索焦亡与结直肠癌之间的关系具有很大的意义,可能对指导结直肠癌的治疗有帮助。诱导焦亡发生分为经典途径和非经典途径。在经典途径中,当机体受到外界刺激如病毒、细菌感染等产生的病原相关分子模式或内部损伤释放的危险相关分子模式时,细胞内的模式识别受体作为感受器识别到这些信号,活化炎症小体,通过接头蛋白ASC连接Caspase-1（CASP1）,使其活化。活化的Caspase-1会剪切gasdermin家族成员GSDMD,释放其氨基端,有活性的GSDMD的氨基端聚集到膜上打孔,破坏细胞膜的完整性,释放内容物,引起炎症。这一分子机制首先被邵峰团队揭示,之后他们又发现,使用化疗药物治疗宫颈癌、神经母细胞瘤等肿瘤时,Gasdermins家族的另一成员GSDME会被Caspase-3（CASP3）剪切,释放有活性的氨基端引起细胞焦亡,提示GSDME作为抑癌基因在诱导细胞焦亡及化疗毒副反应发挥重要作用。但GSDME在结直肠癌焦亡中作用少有人研究。Nigericin源于吸水链霉菌,是一种经典的NLRP3炎症小体活化剂,已有研究发现它能够诱导GSDMD介导的细胞焦亡。但我们通过实验发现在nigericin诱导结直肠癌细胞焦亡的过程中,不仅存在GSDMD的活化、剪切现象,GSMDE也发生活化、剪切。并且随着nigericin作用浓度及时间的增加,细胞焦亡的比例增加,GSDME的活化形式GSDME氨基端（GSDME-N）的蛋白表达量也增加。为了确定GSDME的作用,我们分别在低表达GSDME的细胞中过表达GSDME,在高表达GSDME的细胞中敲降GSDME,结果表明,当过表达GSDME时,nigericin诱导细胞焦亡的比例增多;而敲降GSDME后,细胞焦亡的比例下降,提示GSDME在nigericin诱导的结直肠癌细胞焦亡中发挥重要作用。GSDME是由一个氨基端和一个羧基端两个结构域组成,中间由柔性接头连接。GSDME的全长并不引起细胞焦亡,只有当它被剪切,释放成有活性的氨基端时才会在膜上打孔,引发炎症。那么在nigericin诱导下,什么分子剪切了GSDME呢?目前已有的研究认为GSDME的剪切主要由Caspase-3介导。那在nigericin诱导下,Caspase-3是否发挥了作用呢。首先我们发现在nigericin作用下,存在着Caspase-3的活化现象,通过小干扰技术敲降Caspase-3或加入其特异性抑制剂Z-DEVD-FMK抑制Caspase-3的活性,实验结果显示GSDME的剪切不再发生,并且细胞焦亡的比例下降,提示nigericin通过活化Caspase-3剪切GSDME进而诱导细胞焦亡。在nigericin诱导焦亡的过程中,又是什么分子活化了Caspase-3呢?已知nigericin是经典的NLRP3炎症小体活化剂,可以诱导Caspase-1的活化。那是否是Caspase-1活化了Caspase-3呢?研究发现,在nigericin诱导焦亡过程中,Caspase-1发生了活化剪切;当利用小干扰技术敲降Caspase-1或者加入其特异性抑制剂AC-YVAD-CHO抑制Caspase-1的活性时,Caspase-3的剪切减少、GSDME的剪切减少、细胞焦亡的比例下降,提示nigericin通过活化Caspase-1剪切了Caspase-3。但同时也发现,敲降或加入Caspase-1抑制剂并不能完全抑制Caspase-3的剪切,即细胞内可能还存在别的分子调控Caspas-3的剪切。USF2（upstream stimulatory factor-2）即上游刺激因子2,目前对它的研究主要集中在作为转录因子结合在目的基因的启动子区,正向或者负向调控下游基因的转录跟蛋白表达,从而影响肿瘤的发生发展。实验中发现:在nigericin的作用下,USF2的蛋白表达减少,入核减少。敲降USF2后,nigericin引起细胞焦亡的程度加深,USF2是怎样调控焦亡的呢?已知USF2是一个转录因子,那它是否会调控GSDME呢?通过构建过表达或敲降USF2的细胞系检测两者的相关性,实验发现在m RNA水平上,过表达USF2后抑制GSDME的表达,而敲降USF2后促进GSDME的表达。那么USF2是否作为转录因子负性调控了GSDME的表达呢?通过转录因子结合位点预测网站,我们预测到GSDME的启动子区有2个USF2的结合位点。于是构建了含GSDME启动子区的荧光素酶报告基因质粒,与过表达USF2的质粒共同转染进293T细胞,结果发现,过表达USF2会抑制GSDME的启动子活性。为了进一步确定USF2结合在GSDME的启动子区抑制其转录活性,我们接着构建了删除可能结合位点的GSDME启动子区荧光素酶报告基因质粒,结果发现,删除其中一个的可能结合位点,USF2的抑制作用会减弱,而敲除另一个可能结合位点,USF2的抑制作用不受影响,即USF2确实结合在GSDME的启动子区抑制其转录,但可能还存在别的结合位点有待发现。综合以上实验结果我们得出了以下结论:1.Nigericin通过活化Caspase-1/Caspase-3途径剪切GSDME,诱导结直肠癌细胞发生焦亡。2.细胞焦亡时USF2表达下调、入核减少。3.USF2抑制焦亡的作用与其负性调控GSMDE的转录活性有关。