小麦赤霉病(Fusarium head blight,FHB)是主要由禾谷镰刀菌引起的一种世界性流行真菌病害,导致小麦减产,品质降低,是小麦重要的病害之一。培育和种植抗病小麦品种是最经济、有效的防治途径,但常规育种进展缓慢。随着现代生物技术的发展,利用基因工程等手段有望大大加快育种进程,因此抗病分子机制的解析和抗病基因的克隆是前提。本研究以抗赤霉病品种望水白(Fhb1+)及其感赤霉病突变体NAUH117(Fhb1-)为对象,一方面利用基于高通量测序的转录组分析,揭示Fhb1介导的抗性涉及的分子通路,筛选Fhb1位点抗赤霉病候选基因,在此基础上,克隆抗赤霉病相关基因并研究其功能。取得的主要结果如下:1、利用望水白Fhb1缺失突变体筛选抗赤霉病候选基因以抗赤霉病品种望水白(Fhb1+)及其感赤霉病突变体NAUH117(Fhb1-)为研究对象,结合高通量的RNA测序技术,在转录水平分析和比较两个材料经赤霉病菌侵染后的基因表达差异,筛选Fhb1位点上的关键抗病基因,并进行表达特征分析和功能验证。筛选过程如下:(1)根据公布的中国春3B染色体基因组信息和目前Fhb1的定位信息,将候选基因限定在3B的5-25MB的范围内,该区域共注释360个基因;(2)对本实验室通过染色体分拣和高通量测序获得的望水白3B染色体序列进行拼接,将拼接序列与已公布的中国春3B序列进行比较,注释了来自望水白3B对应5-25MB范围的360个基因;(3)以望水白360个基因为参考序列,利用bowtie软件,将望水白和NAUH117受赤霉菌诱导前后分别测序获得的原始序列(简称reads,长度100bp,双向)进行比对。将能比对到参考基因,且比对上的数目与望水白的没有明显差异的部分参考基因从候选基因中排除(可能来自3A或3D染色体的部分同源基因),将望水白reads没有比对信息的参考基因排除,最后筛选出望水白reads能够比对上的、突变体reads比对不上或比对上数目明显少于望水白(来自部分同源基因的干扰)的参考基因,这些在望水白中表达、而在突变体中不表达或者表达量低的参考基因作为Fhb1的候选基因。最终筛选出14个候选基因,包括3个类受体蛋白激酶,1个葡糖基转移酶,1个tRNA合成酶,1个脂转运蛋白,1个泛素蛋白连接酶以及7个没有具体功能注释的基因。将候选基因在望水白及一个高感小麦赤霉病品种Alondra’s受赤霉菌诱导前后利用Q-PCR进行了表达分析验证,发现其中有2个基因在感病品种Alondra’s中没有表达,但在抗病品种望水白中表达正常,3个基因在感病品种Alondra’s中的表达量远远高于抗病品种望水白,这些结果为后续小麦Fhb1位点抗赤霉病候选基因克隆及其功能验证奠定了基础。2、JA通路参与了小麦抗赤霉病过程本实验室在前期研究中利用基因芯片发现,JA信号通路中的关键基因在望水白受赤霉菌诱导前后有差异表达,推测JA信号通路参与了小麦抗赤霉病反应。本研究首先对抗赤霉病品种望水白和感赤霉病品种Alondras、NAUH117进行喷施外源茉莉酸甲脂(MeJA)激素处理,发现Alondra’s水对照病小穗率为29.01%,而喷施JA后的病小穗率为14.89%,表明在受MeJA处理后可以明显提高其对赤霉病的抗性;NAUH117水处理的病小穗率达24.57%,喷施JA后的病小穗率为12.36%,表明受MeJA诱导处理后也可以明显提高对赤霉病的抗性;而望水白水对照的病小穗率为7.30%,喷施JA后的病小穗率为4.28%,在受MeJA诱导处理后对赤霉病的抗性也有所提高;分别对接种赤霉菌后的抗感赤霉病品种内源JA激素含量测定,结果表明望水白在接种赤霉菌后,内源JA含量在6h之内有明显上升,而NAUH117的内源JA含量在材料受赤霉菌诱导之后则没有上升,表明茉莉酸信号通路在感病材料受赤霉菌诱导之后可能没有被特异性激活。以上生理实验进一步证明茉莉酸信号通路可能参与了小麦抗赤霉病反应。3、望水白抗赤霉病相关基因TaCOI1的克隆和功能鉴定根据前人对于茉莉酸信号通路中关键基因在抗、感赤霉病小麦品种中的表达分析结果,选取了一个茉莉酸信号通路中的关键基因TaCOI1在望水白中进行克隆,得到的cDNA基因全长2300bp。利用大麦条花叶病毒诱导的基因沉默体系(VIGS)在抗赤霉病品种苏麦3号中沉默了 TaCOI1,结果发现,对照在接种赤霉菌15d后病小穗率为1.83%,而在沉默TaCOI1基因之后,病小穗率上升为5.43%,表明在苏麦3号中TaCOI1基因的沉默可明显降低其对赤霉病的抗性。利用基因枪法将TaCOI1基因转化感病品种Alondra’s,共获得180株TO代再生植株,经PCR鉴定结果表明,其中共有7株阳性转基因植株,对其进行赤霉病抗性鉴定,发现在感赤霉病品种Alondra’s中过表达TaCOI1并不能有效提高其抗性。