研究背景:蝾螈是再生研究中的理想动物模型,其具有极强的再生能力,断肢后可以实现完全再生;此外通过外周神经转位也可以诱导异位肢体的再生,因此神经支配对于蝾螈肢体再生过程至关重要。前梯度蛋白2（nAG）是一种具有调控细胞增殖功能的信号分子。有研究表明在绿红东美螈（Notophtalmus viridescens）截肢后,nAG在肢体中的神经断端有大量表达;截肢后高位去神经的肢体丧失再生能力,而在去神经肢体断端处局部电转nAG后可以挽救再生。虽然上述实验证明了nAG在肢体再生过程中起关键作用,但是目前关于nAG对断端附近细胞的生物学效应以及需要何种细胞协同诱导肢体再生仍尚不清晰。方法及结果:本实验首先通过蛋白诱导和纯化进行了nAG重组蛋白的构建,进一步进行nAG多克隆抗体的制备与纯化;同时使用成纤维细胞系作为受试细胞株进行nAG重组蛋白的体外生物学效应检测,结果显示构建的nAG重组蛋白对成纤维细胞具有显著的趋化作用。其次利用实时荧光定量PCR和组织免疫荧光染色技术分析nAG在肢体再生中的表达水平和分布。实时荧光定量PCR分析结果表明,nAG基因在东方蝾螈肢体全再生时间点中的断肢末端处和脊髓处均有表达,且表达变化趋势相似,在14 dpa（days post amputation）时表达量达到峰值。组织免疫荧光染色结果显示,截肢后,nAG蛋白的表达主要定位于断肢末端的表皮处及芽基细胞中,同时在7 dpa和14 dpa时雪旺氏细胞定位处nAG有明显的表达。以上结果提示在再生过程中nAG可能是由脊髓分泌并通过轴突递送至肢体断端处作用于雪旺氏细胞。最后进行了东方蝾螈ALM（The accessory limb model）模型的构建,在术后10天左右芽基组织形成,术后50天左右基本实现了异位肢体的再生。同时基于ALM模型进行动物体内实验,结果显示在nAG（明胶海绵负载）和雪旺氏细胞的协同作用下能诱导具有芽基特征的新生组织形成,该新生组织有明显的增厚上皮结构,表皮下出现大量芽基样细胞和血细胞,且再生早期标志基因Prrx2、Twist2和MLP表达明显上调;同时Brd U标记结果显示细胞增殖显著增加,再生效果近似于ALM模型（阳性对照）。进一步在美西螈肢体伤口处植入雪旺氏细胞并电转am AGR2（nAG同源基因）过表达质粒,同样可以诱导类似ALM模型中的芽基样新生组织形成。结论:本研究中成功表达了东方蝾螈nAG重组蛋白,发现其可以显著促进成纤维细胞系的趋化性侵袭;同时证实nAG在东方蝾螈肢体再生早期芽基形成过程中表达变化显著;在前梯度蛋白和雪旺氏细胞的协同作用下可以诱导蝾螈肢体再生的启动,形成芽基样新生组织。这为蝾螈肢体再生启动机制的进一步研究提供了相关依据。