论文部分内容阅读
屎肠球菌(Enterococcus faecium)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)是两种最常见的产酪胺微生物,在已有的研究中,这两种菌体均具有很强的产酪胺能力。本试验所用的两株菌均是从南京传统食物——盐水鸭中分离出来的产酪胺能力较强的两株菌,通过对两株菌酪氨酸脱羧酶基因以及相应酶的研究,对两个酪氨酸脱羧酶有了更深入的了解。首先对两株产酪胺菌进行了鉴定,确定了两株菌分别属于屎肠球菌和粪肠球菌。同时对两株菌的酪氨酸脱羧酶基因进行了扩增并测序,得到了两株菌酪氨酸脱羧酶基因序列,粪肠球菌R612Z1酪氨酸脱羧酶基因含有1921 bp个碱基,屎肠球菌R615Z1酪氨酸脱羧酶基因含有2006 bp个碱基。通过对比两个酪氨酸脱羧酶基因序列和氨基酸序列,发现两者在序列结构上有很高的相似性,同时也发现位于蛋白结构上的磷酸吡哆醛结合位点,说明了两个酶均为磷酸吡哆醛依赖型脱羧酶。其次利用扩增出的酪氨酸脱羧酶基因构建了相应的表达载体,并对外源表达蛋白进行了SDS-PAGE电泳分析和活性鉴定,得出两个蛋白分子量约为70 kDa,并且两个酶均对两种底物氨基酸(酪氨酸和苯丙氨酸)菌具有催化活性。最后对两个酪氨酸脱羧酶的米氏常数、Vm值、最适pH、最适温度等进行了研究,同时也研究了NaCl浓度对酶活性的影响。最后发现612TDC Kmt=0.021 mol·L-1, Vmax’=2.088 mol·L-1·min-1,最适底物为酪氨酸,最适温度为25℃,最适pH为6.0；而615TDCKmp=0.019 mol·L1, Vmaxp=0.314 mol·L1·min-1,最适底物为苯丙氨酸,最适温度为25℃,最适pH为5.5。NaCl浓度对酶催化酪氨酸的活性影响不大,但是对两个酶催化苯丙氨酸的活性均有很强的抑制作用。