2011年全球转Bt基因抗虫作物面积超过6600万公顷，占转基因作物总面积的45％,其中Bt棉花种植面积已经达到1600万公顷。Bt棉花的种植不仅控制了棉铃虫对棉花造成的危害，增加棉花产量，提高了农民收入，还减少了化学农药的使用量，带来很好的环境效益。随着Bt棉花种植时间的增加，棉铃虫对其产生抗性的风险日益增加，棉铃虫Bt抗性问题是Bt棉花可持续应用的重要限制因素之一。根据近年来的研究报告，已发现我国田间棉铃虫对Bt棉花的抗性等位基因频率在缓慢上升，多种类型的抗性等位基因也陆续被发现，这些抗性基因大多与棉铃虫中肠Bt受体基因的突变相关。但是田间棉铃虫抗性基因未来演化方向如何？抗性处于何种阶段？棉铃虫对Bt毒素的抗性除了钙粘蛋白基因突变外还有哪些机理？这些问题都迫切需要开展进一步的研究。　　在2009年和2012年分别采用F2筛选法对河南安阳地区棉铃虫种群抗性等位基因频率进行了检测，对棉铃虫田间种群对Cry1Ac抗性等位基因进行了分离和鉴定，并对其中一种非隐性、非钙粘蛋白突变的C巧1Ac高抗品系的抗性机理进行了系统研究。研究结果表明，田间棉铃虫抗性等位基因频率已达到5％,抗性基因具有多样化的遗传方式，非隐性抗性个体在抗性个体中占大多数;棉铃虫中肠蛋白酶对Cry1Ac解毒作用增强可以导致对Cry1Ac毒素产生非隐性的高水平抗性。本文的研究结果对开发高效的棉铃虫Bt抗性监测方法和适应性的抗性治理策略提供了重要理论基础。　　1.田间棉铃虫抗性等位基因多样性和非隐性抗性品系选育　　河南安阳地区自1997年开始种植表达Cry1Ac毒素的转基因抗虫棉。为了明确该地区棉铃虫对Bt棉花抗性演化的现状，于2009、2012年采用了F2筛选法对河南安阳棉铃虫种群进行抗性等位基因频率监测。累计对258个单雌系进行了F2筛选，Cry1Ac抗性等位基因频率在2009年为0.052(0.039-0.080)，在2012年为0.056(0.037-0.078)。该结果表明抗性等位基因频率已达较高水平，但3年间变化不大。　　对2009年F2筛选的部分阳性单雌系进一步筛选，获得8个Cry1Ac抗性品系。遗传互补试验结果表明，在这8个田间抗性品系中，6个品系携带隐性遗传的钙粘蛋白抗性等位基因，1个品系携带非隐性遗传的钙粘蛋白抗性等位基因，1个品系(AY423)携带非隐性遗传的非钙粘蛋白抗性等位基因。该结果揭示了在同一个棉铃虫田间种群中存在多样化的抗性机理和遗传方式。根据F2筛选结果进行估算，抗性个体中携带一个非隐性抗性基因的比例高达69.2％-92％，非隐性抗性基因在棉铃虫对Bt抗性演化中具有重要作用。　　与SCD敏感品系相比，AY423品系对Cry1Ac活化毒素抗性达660倍，对Cry1Aa和Cry1Ab毒素有交互抗性，但是对Cry2Ab毒素没有交互抗性。为了更好研究AY423品系的抗性机理，将AY423与SCD进行杂交、重复回交，并进行Cry1Ac筛选，成功构建了遗传背景与SCD一致的近等基因系SCD423。　　2.棉铃虫幼虫中肠Bt受体基因的分析及BBMV与毒素的互作　　昆虫中肠BBMV上受体与毒素结合在Cry1Ac毒素致病过程中发挥着关键作用，毒素受体的改变会引起昆虫对Cry1Ac毒素的抗性。本章探究了SCD423抗性品系中肠受体在Cry1Ac抗性形成中的作用。首先，克隆了10个Bt受体基因(HaCad,HaAPN1-6，HaALP1-2，HaABCC2)，遗传分析表明这10个基因与Cry1Ac抗性不连锁;其次，利用实时定量RT-PCR技术比较了抗性品系SCD423与敏感品系SCD之间10个受体基因mRNA的表达量，各受体表达量差异较小，并通过Western Blot分析发现抗性与敏感品系HaCad受体在蛋白水平上的表达量没有差异;最后，利用ELISA法测定毒素与中肠BBMV饱和性结合，结果表明SCD423抗性品系和SCD敏感品系中肠BBMV与Cry1Ac的亲和力常数值分别为39nM和25nM，差异不明显。根据上述实验结果推断，棉铃虫中肠BBMV毒素受体的变异在SCD423品系的抗性形成过程中不起主要作用。　　3.棉铃虫幼虫中肠蛋白酶在SCD423抗性形成中的作用　　昆虫中肠蛋白酶对Bt毒素的活化和降解有重要的作用，中肠蛋白酶的改变可以导致昆虫对Bt毒素产生抗性。首先通过比较SCD423抗性品系与SCD敏感品系中肠蛋白酶对模式底物活性，在离体条件下对毒素的降解作用，以及蛋白酶抑制剂对毒素的增效作用来探究中肠蛋白酶在抗性形成中的作用;再通过比较抗性和敏感品系蛋白酶基因序列和mRNA表达量的差异来明确与Cry1Ac抗性相关的蛋白酶基因。研究结果表明:　　(1)SCD423品系中肠蛋白酶对模式底物的活性略高于敏感品系，同时对原毒素的活化也快于敏感品系;　　(2)SCD423品系中肠酶液能对Cry1Ac活化毒素N端进一步切除，而SCD敏感品系则不能;　　(3)在SCD423抗性品系中，蛋白酶抑制剂TLCK和TPCK对Cry1Ac具有显著增效作用;　　(4)胰蛋白酶基因HaSP6，HaSP7，HaSP9和HaSP24在SCD423抗性品系中的表达量分别是敏感品系的2.0，3.1，5.0和4.6倍。　　因此，中肠蛋白酶的过量表达导致对Cry1Ac毒素的解毒作用增强是SCD423品系对Cry1Ac产生抗性的重要机理。　　上述研究结果表明，SCD423品系对Cry1Ac毒素的抗性形成与中肠BBMV上毒素受体无关，中肠蛋白酶基因的过量表达是SCD423品系对Cry1Ac毒素产生抗性的重要原因。中肠蛋白酶的改变可以介导棉铃虫对Cry1Ac毒素非隐性遗传方式的高水平抗性形成，为未来靶标害虫对Bt毒素的抗性机理研究提供新的研究思路。针对这种抗性机理，可以在作物中导入蛋白酶抑制剂基因或者其他非Cry1A类家族的Bt基因，以有效延缓靶标害虫抗性演化，提高转基因作物的使用年限。