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花生过敏是由花生中的某些蛋白引起的超敏反应,严重威胁着过敏患者的身体健康。其中Arah 1是花生中一种7S贮藏蛋白,占花生总蛋白的12-16%,约有90%以上的花生过敏患者对其过敏。因此,制备出高纯度的过敏原蛋白Ara h1对于花生过敏研究至关重要。本论文工作包括(1)Arah 1实验室纯化方案的研究;(2)Arah 1的小试规模放大纯化;(3)花生过敏原蛋白Arah1纯化的中试工艺设计。研究的主要内容、结果和结论如下。1.采用硫酸铵分级沉淀法(0%、80%、100%)处理花生蛋白浸提液,并设计了三种层析纯化方案进行预实验,最终确定先阴离子交换层析(柱床规格1.6cm×36cm,流速 1.5ml/min,0-300mmol/LNaCl 浓度梯度洗脱,500ml),再羟基磷灰石层析(柱床规格 1.6cm×6cm,流速 0.8ml/min,20-100-150-200mmol/L磷酸盐缓冲液阶梯式梯度洗脱)的两步纯化策略。对该层析纯化方案进行的重复实验表明,该方法具有很好的稳定性,一次纯化周期Arah 1的产量在120mg以上,最终得到的Arah 1经SDS-PAGE电泳检测,纯度为90%以上。对纯化蛋白进行蛋白质肽指纹质谱分析表明,电泳中190kD、64kD、33kD的条带分别为Arah 1三聚体、Arah 1单体、Arah 1片段。该纯化方法通量大、稳定性好、设备简单、纯化产品纯度高,适合于小试规模放大实验。2.完成了基于层析纯化方案的10倍放大小试实验,即阴离子交换层析柱床规格3.5cm×36cm,流速7.2ml/min,洗脱缓冲液浓度范围不变,体积为2,400ml;羟基磷灰层析柱床规格2.6cm×18cm,流速1.5ml/min,洗脱缓冲液浓度范围不变。多次重复实验表明该纯化方案重现性好,一次纯化周期中Arah 1的产量达到1克以上。将实验室预实验纯化得到的Ara h 1与小试纯化得到的Ara h 1进行圆二色光谱分析和ANS荧光探针表面疏水性分析,结果表明它们的二级结构和蛋白表面疏水性无明显差异。另外,产品的得率和纯度得到了很好的保持,为后面的中试设计提供了可靠的实验参数。3.设计完成了适合于Arah 1中试生产的工艺流程,规模为小试纯化规模的10倍,即一个纯化周期得到l0g以上纯度在90%以上的Ara h 1。通过设计完成了设备选型,并绘制了 Ara h 1中试纯化工艺的设备流程图,为Ara h 1的工业化制备奠定了基础。