背景:缺血性脑卒中是一种由于各种原因引起的脑部分区域血流中断或明显减少,脑组织代谢障碍,继而导致脑细胞不可逆损伤或死亡的严重脑血管疾病,具有较高的发病率、致残率和死亡率。目前,主要有两种治疗措施,一是溶栓治疗,但其仅4.5h的时间窗及其可能的严重副作用限制了其措施的广泛应用;另一种为神经保护治疗,半暗带的存在给此疗法提供了理论证明,但目前尚无特效药。因此,加强内源性细胞保护作用或减少导致细胞损伤的代谢途径的激活成为研究缺血性脑卒中治疗的新靶点。缺血性脑卒中发生后会出现血脑屏障（Blood Brain Barrier,BBB）的损伤,大量研究证明,BBB损伤会加重缺血性脑卒中后的脑损伤和炎症水平。BBB损伤在缺血性脑卒中过程中起着重要作用,BBB形成的关键是内皮细胞,内皮细胞上表达白细胞介素1受体1型（Interleukin-1 receptor type 1,IL1R1）。已有研究表明,该受体的激活会介导BBB内紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5表达的减少导致BBB的破坏以及增加黏附分子VCAM-1和ICAM-1的表达导致外周免疫细胞向脑内浸润增加。GSDMD（Gasdermin D,GSDMD）介导的细胞焦亡释放的白细胞介素1β（Interleukin-1β,IL-1β）是IL1R1受体的主要配体,可作用于内皮细胞使其产生上述变化。小胶质细胞作为大脑常驻的固有免疫细胞,是脑缺血损伤后最早做出应答的细胞,对中枢神经系统炎症的发生至关重要,且已有研究证明小胶质细胞可发生焦亡释放大量IL-1β。目前尚未有研究探讨缺血性脑卒中中小胶质细胞焦亡在BBB损伤中的作用,因此我们推测缺血性脑卒中后小胶质细胞可能通过焦亡释放的IL-1β,作用于内皮细胞IL1R1受体进而对BBB造成损伤。目的:1.明确GSDMD蛋白介导小胶质细胞发生焦亡在缺血性脑卒中引起BBB损伤中的作用;2.探讨脑内皮细胞IL-1 β/IL1R1信号通路在缺血性脑卒中引起BBB损伤中的作用机制。方法:在体内研究水平上,构建小鼠大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型,应用激光散斑血流成像系统检测模型构造情况,采用磁共振检测小鼠梗死体积和mNSS评分评估小鼠神经功能缺损情况,应用免疫荧光染色检测GSDMD在小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元中的表达情况,应用Western Blot、EB染色、RT-qPCR及免疫荧光检测BBB紧密连接蛋白表达情况。在体外研究水平上,采用小胶质细胞与内皮细胞氧糖剥夺/复氧（Oxygenose deprivation/reoxygenation,OGD/R）共培养,分别外源性添加双硫仑（Disulfiram,DSF）抑制小胶质细胞焦亡以及IL1R1受体拮抗剂IL1RA,应用LDH、WB、RT-qPCR技术和免疫荧光染色检测小胶质细胞对内皮细胞的影响。结果:1.构建小鼠MCAO模型和分组:用激光散斑成像技术评估建模成功与否,最终只纳入符合标准的MCAO模型鼠入实验组。分组为Sham-WT组、Sham-KO组、MCAO-WT组、MCAO-KO组,共四组,每组6只小鼠。2.体内实验探讨GSDMD蛋白对MCAO后小鼠BBB的影响:（1）小鼠磁共振显示,与MCAO-WT组相比,MCAO-KO组脑梗死体积明显下降（P＜0.05）。（2）行为学评分结果显示,MCAO后小鼠均出现神经行为功能损伤,与Sham组小鼠相比MCAO组小鼠的mNSS评分明显增高;与MCAO-WT组相比,MCAO-KO组mNSS评分较低,术后第2d差异开始表现出统计学意义（P＜0.0001）,表明敲除GSDMD对MCAO小鼠具有保护作用。（3）伊文思蓝渗透性检测显示,在MCAO后伊文思蓝出现明显的脑内的渗入,而Sham组小鼠脑内明显没有发现渗入,说明MCAO模型损伤了小鼠BBB的完整性。而与MCAO-WT组小鼠相比,MCAO-KO组小鼠伊文思蓝向脑内的渗透显著减少（P＜0.01）,说明敲除GSDMD可减轻MCAO导致的BBB破坏。（4）脑水肿检测显示,与Sham组相比,MCAO-WT组小鼠脑含水量明显增加,MCAO-KO组小鼠脑含水量较MCAO-WT组小鼠降低（P＜0.0001）,表明敲除GSDMD可减轻MCAO导致的脑水肿。（5）探究小鼠MCAO后脑内产生焦亡的情况,Western blot及荧光定量PCR术检测GSDMD及IL-1 β表达情况,MCAO组GSDMD及IL-1β表达明显高于Sham组,表明MCAO后脑内发生明显焦亡。（6）探究GSDMD对紧密连接蛋白和黏附分子的影响,Western Blot检测紧密连接蛋白ZO-1、occludin、claudin-5和黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表达,免疫荧光染色检测ZO-1和claudin-5的表达,结果表明,与Sham组相比,MCAO组紧密连接蛋白表达明显减少,黏附分子表达明显增多;与MCAO-WT组相比,MCAO-KO组紧密连接蛋白表达增多,黏附分子表达减少,说明敲除GSDMD可减轻MCAO后紧密连接蛋白的减少,并减少黏附分子的表达。（7）探究脑内GSDMD作用的主要机制,免疫荧光染色检测脑内星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元和小胶质细胞表达GSDMD的情况,结果显示小胶质细胞表达GSDMD蛋白最为显著;免疫荧光染色检测脑内皮细胞表达IL1R1受体的情况,结果表明内皮细胞上丰富表达IL1R1受体。3.体外实验探讨GSDMD蛋白BBB影响的作用机制（1）体外培养BV2细胞,通过免疫荧光染色、荧光定量PCR术和LDH检测OGD/R后小胶质细胞的焦亡情况,结果显示,OGD/R后小胶质细胞GSDMD蛋白表达和LDH释放明显增加,而加入GSDMD抑制剂DSF后,GSDMD、IL-1β表达和LDH释放均明显降低,表明小胶质细胞在氧糖剥夺后可发生明显焦亡。（2）体外将小胶质细胞与微血管内皮细胞共培养,通过Western Blot和免疫荧光染色检测小胶质细胞对内皮细胞的影响,结果显示OGD/R后的小胶质细胞使内皮细胞紧密连接蛋白表达减少;与OGD/R组相比,小胶质细胞加入GSDMD抑制剂DSF可减轻内皮细胞紧密连接蛋白的表达减少;与OGD/R组相比,内皮细胞内加入IL-1β抑制剂IL1RA也可减轻内皮细胞紧密连接蛋白的表达减少,表明小胶质细胞焦亡可能通过内皮细胞表面的IL1R1受体作用于内皮细胞使其表达紧密连接蛋白减少,影响其功能。结论:1.抑制GSDMD介导的小胶质细胞焦亡对缺血性脑卒中后BBB具有保护作用;2.GSDMD介导的小胶质细胞焦亡可能通过释放IL-1β,作用于内皮细胞IL1R1受体进而对缺血性脑卒中后BBB造成损伤。