铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa.PA)，又名绿脓杆菌，是假单胞菌属的代表菌种，革兰阴性，在自然界分布广泛。铜绿假单胞菌是一种机会致病菌，它可以在人群中引起严重的急性和慢性感染，是病人在医院期间发生感染的第三大致病菌。许多抗生素对其具有一定的治疗作用，但铜绿假单胞菌对许多抗生素具有很高的内在抗药性。为了解决这一问题，需要从分子生物学水平更深入地开展研究。 质粒是一种相对简单的遗传物质，携带丰富的遗传信息，并且容易分离提纯和在体外进行操作，加上其相对独立，不影响宿主的生存，从而为深入研究DNA复制机理、基因的结构和功能，以及基因的表达和调控提供了良好的条件。 本研究于西安护城河中取水样，分离假单胞菌，进行质粒抽提。分离纯化一大小合适的质粒DNA片段，命名为pMMl。采用BamHI限制性酶切，胶回收酶切片段、与同样酶切的载体pUCl9连接，以M13通用引物为测序引物，通过引物步移(PrimerWalking)的方法进行测序。测序结果显示质粒pMMl全长2140bp，G+C含量为45.8％。 对质粒pMMl进行生物信息学分析，质粒。pMMl上存在着一个编码374个氨基酸、长为1125bp的开放阅读框(ORF 742bp.1683bp)，并且此ORF与质粒滚环复制(RCR)VIII家族Rep氨基酸编码序列同源，推断此ORF为Rep蛋白编码区。利用基于计算法和热力学知识预测RNA/DNA核苷酸二级结构杂交和解链结构的软件确定出参与复制的SSO和dso区。pMMl具备质粒滚环复制(RCR)VIII家族的所有性质特征，推测其复制类型属于(RCR)VIII家族，为铜绿假单胞菌的一个新型隐秘质粒。 利用error-prone PCR体外突变方法，突变pMMl，构建出一个在30。C生长而在42。C不长的温度敏感型铜绿假单胞菌载体pMM8，将此载体克隆进pUCl9的多克隆位点，得到大肠杆菌、铜绿假单胞菌穿梭载体pUM8。对温敏质粒pMM8测序，结果显示参与复制的S80和出D区分别有一处碱基发生突变。利用pUM8质粒载体通过基因同源重组的方法成功敲除了铜绿假单胞菌的PA3899基因。这一铜绿假单胞菌温度敏感载体pUM8为进一步从分子生物学水平研究铜绿假单胞菌提供了技术支持。