EGFR突变细胞系HCC827-TR获得性耐药机制及Afatinib逆转耐药研究

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背景与目的:肺癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一,化疗药物因其毒副作用影响了对肺癌的治疗价值。近年来随着对肺癌发病机制及分子靶向治疗深入研究,人们研究发现80%以上的肺癌患者EGFR高表达,针对EGFR分子治疗的药物有多种,其中EGFR胞内酪氨酸激酶的小分子抑制剂,即EGFR-TKIs在临床研究发现,EGFR-TKIs对于大部分EGFR突变的患者,初始有非常好的疗效,尤其对突变类型为19外显子的缺失突变和21外显子的L858R点突变患者,随着药物应用时间的延长,都不可避免的产生耐药。关于获得性耐药的机制主要包括EGFR的T790M二次突变和MET基因扩增,约占70%,尚有30%-40%的耐药机制不清楚,主要有PTEN表达缺失或功能异常、IGF-1R高表达、HGF高表达等。为进一步研究EGFR-TKIs获得性耐药机制,我们利用前期已经诱导成功的耐药细胞株HCC827-TR和敏感株HCC827-P,通过用不同方法对已知EGFR-TKIs获得性耐药机理的筛查。已知最常见的获得性耐药机制是EGFR的20外显子发生T790M二次突变,而肿瘤的活性仍然依赖EGFR信号传导通路,因此如何阻断EGFR信号传导通路是克服耐药的关键。目前主要逆转耐药的研究包括联合EGFR单抗治疗、不可逆的EGFR-TKIs抑制剂和T790M突变抑制剂。本课题主要对不可逆的EGFR-TKIs抑制剂阿发替尼进行研究。介于H1975和H1650细胞株分别为EGFR外显子21的点突变(L858R)和外显子19的缺失突变(E746-A750del),其中H1975同时伴发外显子20的二次突变(T790M),我们选用H1975和H1650细胞株进行有关实验,初步探讨阿法替尼逆转EGFR-TKIs获得性耐药可能性。方法:1.人体外培养HCC827-P、HCC827-TR细胞。提取总RNA,进行反转录成cDNA,通过Realtime-PCR检测二者细胞内PTEN基因mRNA表达水平。2.Western-blot检测HCC827-P和HCC827-TR细胞中PTEN的表达水平,同时检测经5μM Erlotinib处理2h后的HCC827-P和HCC827-TR细胞中EGFR下游靶蛋白p-AKT表达水平。3.MTS检测Afatinib和Erlotinib在H1975和H1650细胞系中的毒性作用。结果:1. Realtime-PCR检测结果显示HCC827-TR和HCC827-P细胞系中二者的PTEN mRNA表达水平不一致;其中HCC827-TR细胞系的PTEN基因mRNA表达水平较HCC827-P细胞系低。2. Western-blot检测显示HCC827-TR细胞中PTEN蛋白表达缺失;给予EGFR-TKI抑制剂Erlotinib5μM处理2h后,HCC827-P细胞系的下游信号蛋白p-AKT明显被抑制,未经Erlotinib处理的HCC827-TR细胞中p-AKT水平轻度上调。3. Afatinib对H1975存在生长抑制作用。当Afatinib和Erlotinib药物浓度均为10μM时,二者对H1975的生长抑制率分别为58%、14%,IC50分别为9.03μM和33.16μM。Afatinib对H1650的生长抑制作用强于Erlotinib,当Afatinib和Erlotinib药物浓度均为0.001μM时,二者对H1650的生长抑制率分别为15%、6%,IC50分别为8.45μM和19.82μM结论:1. HCC827-TR对Erlotinib获得性耐药机制可能与PTEN蛋白表达下调导致的p-AKT持续活化有关。2. Erlotinib可显著抑制HCC827-P细胞内EGFR下游的PI3/AKT信号通路,而对HCC827-TR细胞的抑制作用不显著。3. Afatinib能够逆转由T790M突变导致的耐药,对于由PTEN蛋白表达缺失或下调引起的耐药也有一定程度的逆转作用。
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