F13（3-溴代乙酰胺-4-甲氧基-苯甲酰脲）是本所合成室宋丹青教授课题组合成的一个小分子化合物。其母体化合物及其它衍生物可抑制β-微管蛋白聚合,阻断肿瘤细胞周期于M期,进而诱导凋亡。以前的研究结果表明,F13不引起肿瘤细胞周期阻滞,丧失了先导化合物的抗微管微丝作用,但仍具有相似的抗肿瘤作用。本研究主要目的是探讨F13潜在的抗肿瘤作用及机制。研究结果如下:1.初步探讨F13的抗肿瘤作用首先我们检测了F13对多种肿瘤细胞系的体外生长抑制作用,包括人纤维肉瘤细胞,人乳腺癌细胞,多药耐药的人乳腺癌细胞MCF7/DOX,人结肠癌细胞,人非小细胞肺癌细胞,人肝癌细胞,以及人正常肝细胞L02。F13在所试验肿瘤细胞系中的IC₅₀值范围为1.11到4.52μg/ml,略低于人正常肝细胞系L02(IC₅₀值为4.66μg/ml)。具有高转移能力的人纤维肉瘤细胞系HT-1080的IC₅₀值为2.52μg/ml。接着,我们在昆明小鼠中检测了F13对H22移植瘤的体内生长抑制作用。结果表明,40 mg/kg F13对H22移植瘤的抑瘤率为44.4%,阳性对照药MMC的抑瘤率为30.4%,10 mg/kg以及20 mg/kg的F13对H22移植瘤的生长没有明显的抑制作用。最后,我们采用基因芯片的方法检测了F13对细胞基因水平的影响。结果显示,2.5μg/ml F13在MCF7细胞中引起310个基因的表达变化在1.5倍以上。发生变化的基因参与包括细胞骨架调节、凝着斑、MAPK、细胞外基质-受体相互作用、细胞粘附分子、Wnt、β-TGF、粘附连接等细胞调节通路,这些通路与细胞的运动、粘附以及增殖密切相关,由此,我们提出假设:F13可能影响细胞的运动、转移能力。因此,我们在下一步实验中选择一株具有高转移能力的细胞系HT-1080用于探讨F13对其运动、侵袭、以及粘附能力的影响。2.F13对人纤维肉瘤HT-1080细胞的抗肿瘤作用基于实验室以前的结果,我们再次检测了F13对HT-1080细胞周期的影响。流式细胞仪检测结果表明F13没有引起细胞周期分布的明显变化,与实验室以前的结果一致,证实F13的抗肿瘤作用不依赖于周期阻滞。在实验过程中,我们发现高浓度F13（≥5μg/ml）在给药后2 h即可引起HT-1080细胞皱缩,变圆。2.5μg/ml的F13在给药后4 h也可引起部分细胞发生类似的形态学变化。而1μg/ml的F13对细胞形态没有明显的改变。并且,HT-1080细胞经F13短时间处理（如2 h,4 h,6 h,8h,或24 h）后撤药,换成新鲜培养基继续培养至24 h,48 h,或72 h,其生长抑制率与持续给药组细胞没有显著差异。说明F13对HT-1080细胞具有快速而不可逆转的杀伤作用。文献报道指出,细胞内钙离子过载或细胞内外钙离子平衡被打破时,可导致细胞毒作用,并诱发细胞凋亡或坏死。因此,我们也检测了F13对HT-1080细胞内钙离子浓度的影响。流式细胞仪结果显示,高浓度F13（5μg/ml,10μg/ml）在给药后1 h即可引起细胞内钙离子浓度的增加。2.5μg/ml F13在给药后4 h后也引起细胞内钙离子浓度升高。而在整个过程中,1μg/ml F13处理的细胞,其细胞钙离子浓度与对照组细胞相比,没有发生明显的变化。F13引起HT-1080细胞内钙离子浓度随时间的变化趋势与我们先前观察到的细胞形态变化趋势一致,表明,F13引起的HT-1080细胞杀伤作用可能与细胞内钙离子浓度的改变有关。我们进一步测定了F13对HT-1080的增殖抑制作用。结果表明,F13对HT-1080的增殖抑制作用具有时间和剂量依赖性。浓度为2.5～5μg/ml的F13可显著抑制细胞的生长,而浓度为0.5～1μg/ml的F13在第6天以前,对细胞的生长不存在显著性影响,该结果提示,小于1μg/ml的浓度可能是一个亚毒性剂量,该浓度范围被我们在后续实验中用于研究F13对细胞运动、侵袭、和粘附能力的影响。对于F13引起的细胞凋亡,Annexin-V/PI双染显示,高浓度F13（2.5和5μg/ml）在12 h和24 h都引起HT1080细胞早期凋亡和晚期凋亡比率增加;而1μg/ml F13处理的细胞,在12 h和24 h的凋亡比率与对照组相比都没有出现明显的变化。F13浓度大于1μg/ml时可引起HT-1080细胞凋亡,这一结果同样被Tunnel染色证实。Western Blot结果显示,F13处理浓度达到2.5μg/ml后,35 kDa的caspase 3蛋白水平下降,而PARP产生明显的85 kDa条带,这一结果与F13引起的凋亡一致。在研究F13是否抑制细胞运动、侵袭和粘附能力时,我们首先确定了F13的HNTC（Highest non-toxic concentration）,从而排除F13直接的生长抑制作用干扰实验结果,结果表明,≤1μg/ml的F13浓度属于HNTC范畴,该浓度被我们用于后续实验。划痕实验和Transwell运动实验表明F13（0.25～1μg/ml）剂量依赖性抑制HT-1080细胞的运动能力,具有统计学意义。基于Matrigel的Transwell侵袭实验表明,F13（0.25～1μg/ml）剂量依赖性抑制HT-1080细胞的侵袭能力,具有统计学意义。细胞粘附实验表明,F13剂量依赖性抑制HT-1080细胞对FN的粘附能力。接着,我们探讨了F13抑制HT-1080细胞运动、侵袭、粘附的机制。我们利用明胶酶谱法检测F13是否引起HT-1080细胞上清中MMP-2和MMP-9活性的改变。结果显示,对照组细胞可见两条清晰的电泳负染条带,分别为MMP-9和MMP-2。而药物处理组细胞的负染条带显著减弱,并呈剂量依赖性。其后,我们用实时RT-PCR法检测MMP-2和MMP-9的mRNA表达。结果显示,药物处理细胞的MMP-2和MMP-9表达均略高于对照组细胞。表明,F13引起HT-1080细胞上清中MMP-2和MMP-9活性下调不是基因表达的直接结果,而是转录后翻译引起的。RECK（the reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motifs）是新发现的一个基质金属蛋白酶抑制剂,可通过多种机制抑制MMPs活性。RT-PCR检测结果表明,HT-1080细胞本身的RECK表达水平很低,F13（0.5～1μg/ml）处理后,其RECK的mRNA表达呈剂量依赖性增加。文献报道指出,ERK信号通路可负调节RECK表达,在本研究中,Western Blot检测结果表明,F13（0.5～1μg/ml）在HT-1080细胞中显著抑制ERK1/2的磷酸化,并呈剂量依赖性。而ERK1/2的总蛋白水平保持不变。此外,MEK1和MEK2的选择性抑制剂U0126同样抑制ERK1/2的磷酸化活化。这些间接证明了F13通过ERK1/2信号通路上调RECK表达。此外,我们也检测了F13对整合素通路的影响。实验结果表明,F13引起多个整合素亚基β1,β5和β6表达下调,并引起整合素下游的信号分子如FAK,Akt磷酸化水平降低。这些结果表明,F13可能抑制了整合素-凝着斑激酶通路,但仍需进一步实验证实。同时,Western Blot结果表明,F13剂量依赖性抑制NF-κB的活化。最后,基因芯片检测结果表明,1μg/ml F13引起HT-1080细胞457个基因表达变化2倍以上。变化的基因参与包括MAPK、凝着斑、细胞骨架调节、细胞粘附分子、细胞外基质-受体、粘附连接等调节通路,这些通路与细胞的运动、粘附和增殖密切相关。芯片结果显示,RECK表达变化1.6倍,与先前的实验结果基本一致。综上所述,苯甲酰脲衍生物F13剂量依赖性抑制细胞的生长、运动、侵袭和粘附,并诱导凋亡。高浓度F13引起的细胞凋亡可能与细胞内钙离子浓度改变相关,低浓度F13可能通过诱导ERK1/2介导的RECK表达,下调MMP-2/9的活性,进而抑制细胞侵袭、转移。RECK是新发现的一个MMP抑制剂,作为RECK的诱导剂,F13具有进一步研究的价值。