干扰TRIP13基因对结直肠癌细胞HCT116增殖的作用

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背景:从流行病学上来看,结直肠癌(colorectal cancer,CRC)的发病率和死亡率均令人堪忧。在我国所有恶性肿瘤之中,CRC的发病率位居第3-5位。在欧美国家所有恶性肿瘤中,CRC的发病率居第2-3位。在全球癌症相关的死亡原因中,结直肠癌是第四大原因。多数CRC患者就诊时已属中晚期,经手术治疗、放疗、化疗等治疗后发生肿瘤耐药、进展、复发几率较高。基因诊断与治疗为打破CRC传统防治模式提供了一个新的方向,发现与CRC相关的基因并探究其致病机制是迈向这个方向的前提。甲状腺激素受体因子13(Thyroid Hormone Receptor Interactor 13,TRIP13)基因位于5号染色体短臂1区5带,它是一个蛋白编码基因。TRIP13基因参与细胞减数分裂和有丝分裂的相关过程,能通过干扰纺锤体组装检查点进而影响有丝分裂过程,从而导致肿瘤的发生、发展,它被确定为癌基因。TRIP13的过度表达可导致多种人类癌症,目前尚未证实TRIP13基因与CRC相关,TRIP13基因与CRC的关系尚待进一步研究。目的:本实验拟研究TRIP13基因在结直肠癌HCT116细胞中的表达情况,然后用慢病毒感染HCT116细胞的方法构建TRIP13基因过表达和TRIP13基因敲减的HCT116细胞,并检验慢病毒干扰效果。随后,通过进行一系列细胞功能检测(包括细胞周期检测、细胞凋亡检测、克隆形成检测、MTT检测)来研究TRIP13对胃癌细胞生物学特性的影响,探究干扰目的基因TRIP13对HCT116细胞增殖的影响,进一步探讨TRIP13对结直肠癌细胞的生物学作用,为后续结直肠癌基因诊断和治疗提供初步实验依据。方法:(1)采用实时荧光定量检测系统(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction Detecting System,qPCR)检测HCT116细胞中TRIP13基因的表达,使用TRIP13基因RNA干扰序列的慢病毒感染目的细胞,再用qPCR检测mRNA水平TRIP13基因敲减的效率,若TRIP13基因敲减效率<50%,继续进行慢病毒感染;若TRIP13基因敲减效率>50%,进行下一步细胞功能检测。(2)在体外细胞功能实验部分,细胞周期检测使用碘化丙啶(Propidium,PI)染色流式细胞仪检测法,来探究TRIP13基因对HCT116细胞生长周期的影响;细胞凋亡检测采用Annexin V-APC单染法,研究TRIP13基因与HCT116细胞凋亡的关系;克隆形成检测使用Giemsa染色法,探究用含有目的基因RNA干扰序列的慢病毒感染后HCT116细胞的成瘤能力;通过MTT检测探究TRIP13基因对HCT116细胞增殖的影响。(3)使用Spss 21.0软件进行统计分析。结果:(1)HCT116细胞中高丰度表达TRIP13基因,慢病毒感染HCT116细胞效率达到80%以上,细胞状态正常,HCT116细胞中TRIP13基因在mRNA水平的表达量下降(p<0.05),敲减效率达到85.5%。(2)细胞周期检测结果:相比对照组(shCtrl组),实验组(shTRIP13组)处于S期的细胞减少(P<0.05),处于G1期的细胞增加(P<0.05),处于G2/M期的细胞无显著变化。(3)细胞凋亡检测结果:与shCtrl组相比,shTRIP13组凋亡细胞数增多(P<0.05)。(4)克隆形成检测结果:与shCtrl组相比,shTRIP13组克隆形成数减少(P<0.05)。(5)MTT检测结果:相比shCtrl组,shTRIP13组细胞增殖减缓。结论:干扰目的基因TRIP13抑制结直肠癌细胞HCT116的增殖。TRIP13基因为结直肠癌的的防治提供了一个新方向,它可能是CRC治疗的一个潜在靶点,为实现CRC的可靠诊疗具有基础的实验依据。
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