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目的:蒽环类抗肿瘤药物阿霉素(Doxorubicin,DOX)具有抗瘤谱广及疗效高的特点,主要用于血液系统肿瘤和多种实体瘤的治疗.然而,蒽环类药物的临床应用常因其严重的毒性而被迫停药,其中心血管毒性是其被迫停药的主要原因,DOX诱发心血管毒性的机制尚不完全清楚.一般认为,氧化应激、炎症和凋亡均参与DOX所致的心血管毒性.然而,近年来临床研究发现,儿童白血病患者经DOX治疗生存时间超过10年者其心脏功能未见明显受损,但多数患者有血脂异常和血管内皮功能的明显受损.这些发现提示,DOX的心脏毒性作用除了和其可直接引起心脏毒性损伤外,血脂紊乱和血管损伤所继发的心功能受损可能也参与DOX心脏毒性的发生,但目前这方面的基础研究尚少.此外,对肿瘤的研究发现,肿瘤细胞对DOX的耐药性可能和其促进脂质在肿瘤细胞的沉积有关,但DOX其是否可促进脂质在血管内皮的沉积目前尚未见报道.APOE基因敲除(APOE-/-)小鼠是常见的研究药物对血管内膜脂质沉积影响的重要模型之一,因此本研究首先采用APOE-/-小鼠,观察DOX是否可加重脂质在动脉的沉积并导致心功能受损.其次,采用体外培养的人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),观察DOX单独或联合应用油酸(OA,不饱和脂肪酸)或棕榈酸(PA,饱和脂肪酸)对内皮细胞的毒性作用,并对其可能的毒性机制进行分析.该研究可从全新的角度解释DOX的心脏毒性作用机制.
方法:
1整体动物实验
选取7-8周龄的雄性APOE-/-小鼠20只,体重27±2g,随机分为5组,4只/组.分别为正常饮食组(Normal diet)、高脂饮食组(high fat diet),高脂饮食加DOX+2.5mg/kg组、5mg/kg组和10mg/kg组(以下简写为DOX2.5mg/kg、DOX5.0mg/kg、DOX10.0mg/kg).在动物给予高脂饮食一周后,DOX各处理组一次性给予不同剂量的DOX,正常饮食组和单纯高脂饮食组给予等量生理盐水,各组均采用腹腔注射给药,给药容积均为1ml.观察并记录各组动物的每日摄食量,一周左右称重一次,每2周左右测定1次血浆总胆固醇(TC)水平.给予阿霉素后第8周采用小动物超声分析仪检测小鼠心脏射血分数(EF)、缩短分数(FS)、左室等容收缩时间(IVCT)和左室等容舒张时间(IVRT)等指标,并于第9周末最后一次称重后处死小鼠.分离和摘取腹主动脉全长和心脏,用4%多聚甲醛固定过夜,腹主动脉全长采用油红O染色观察主动脉血管内斑块的形成情况,心脏组织采用蔗糖梯度脱水(15%蔗糖24h,30%蔗糖24h)48h后,心房组织(心脏流出道部分)做冰冻切片,OCT包埋,液氮速冻,用冰冻切片机切片,切片厚度为9μm,油红O染色观察心脏流出道内脂质沉积形成情况.心室组织采用HE染色观察心室肌的病变情况.
2体外细胞实验
2.1DOX、OA及PA对HUVECs存活率的影响
体外培养HUVECs,分别给予不同浓度的DOX、OA、PA和细胞作用24h和48h,采用MTT法测定24h及48h各处理组HUVECs的存活率,确定HUVECs存活率为50%~80%的DOX、OA及PA的时间和浓度.之后,采用DOX和OA/PA联合处理细胞,检测其对细胞存活率的影响.
2.2DOX单独或联合应用OA或PA对HUVECs脂质沉积的影响
将处于对数生长期的HUVEC细胞随机分为7组,分别为①Control组(简写:Con组)、②DMSO组、③DOX组、④OA组、⑤PA组、⑥DOX+OA组、⑦DOX+PA组.DOX、OA及PA的浓度分别为1μM、150μM及100μM,将以上各给药组置培养箱中培养24h,油红O染料染色观察各组细胞内脂质沉积情况.
2.3DOX或FABP4单独或联合应用OA或PA对HUVECsROS的影响
培养HUVECs,分组和给药如前,将细胞用活性氧分子(ROS)特异性荧光探针2,7-dichlorofluorescenindiacetate(DCFH-DA)1μM染色30min,激光共聚焦显微镜检测细胞荧光强度,以此反映ROS的含量.
另取一组HUVECs,随机分为5组,分别为①Control组(简写:Con组)、②DMSO组、③OA组、④PA组、⑤FABP4+OA组、⑥FABP4+PA组.FABP4、OA及PA的浓度分别为100ng/ml、150μM及100μM,将以上各给药组的细胞置培养箱中培养24h,用激光共聚焦显微镜检测ROS水平.比较FABP4与OA/PA联合应用对细胞荧光强度的影响.
2.4DOX单独或联合应用OA或PA对HUVECsMDA的影响
培养HUVECs,分组和给药如前,取细胞裂解液,用紫外分光光度计测定蛋白浓度,按MDA试剂盒说明书测定MDA水平.
2.5DOX单独或联合应用OA或PA对HUVECsFABP4和Mn-SODmRNA的影响
培养HUVECs,分组和给药如前,采用RT-PCR法观察HUVECsFABP4和Mn-SOD的mRNA的表达情况.
结果:
1整体动物实验:
1.1动物一般情况
正常饮食组、单纯高脂饮食组动物一般活动、摄食量及体重在整个观察期内均未见异常.而高脂饮食+DOX2.5、5.0组和10.0mg/kg组和单纯高脂饮食组相比,小鼠出现活动量减少、皮毛粗糙及竖毛现象.DOX5.0及10.0mg/kg组36天后动物体重明显减轻(P<0.05或0.01)并持续到整个观察期结束.摄食量各组未见明显差别.
1.2DOX对APOE-/-小鼠心功能的影响
心脏超声结果显示,与正常饮食组相比,APOE-/-小鼠单纯高脂饮食组EF、FS、IVCT和IVRT没有明显差异;与单纯高脂饮食组相比,高脂饮食加DOX5.0、DOX10.0mg/kg组EF和FS明显降低(P<0.01),但是VICT和VIRT没有明显变化.高脂饮食加DOX2.5mg/kg组对上述指标均没有明显影响.
1.3血浆TC的测定结果
给药前,各组动物血浆中的TC水平未见明显差异.给药后第33天、47天及60天,与正常饮食组相比,单纯高脂饮食组小鼠血浆中TC明显升高(P<0.01);与单纯高脂饮食组相比,高脂饮食加DOX2.5、5.0mg/kg组血浆中TC未见明显变化,高脂饮食加DOX10.0mg/kg组血浆中TC明显升高(P<0.05).
1.4DOX对APOE-/-小鼠主动脉斑块形成的影响
正常饮食组主动脉血管只有极少量斑块;单纯高脂饮食组斑块数量、面积大于正常饮食组;高脂饮食+DOX各给药组斑块数量、面积与单纯高脂饮食组有增多的趋势,并且随着剂量的增大,趋势越明显,还伴有动脉血管壁硬化、管腔变小的现象.
1.5DOX对APOE-/-小鼠心脏流出道脂质沉积的影响
正常饮食组心脏流出道部分未见脂质沉积;与正常饮食组相比,单纯高脂饮食组心脏流出道有脂质沉积;与单纯高脂饮食组相比,高脂饮食加DOX给药组心脏流出道脂质沉积更多,并且心脏三尖瓣处均有见脂质沉积.
1.6DOX对APOE-/-小鼠心脏组织病理学影响
小鼠心室肌HE染色显示,APOE-/-小鼠单纯高脂饮食组与正常饮食组相比除心肌间空隙增大外,没有明显变化.但是DOX各给药组与单纯高脂饮食组相比细胞排列紊乱、血管壁增厚、细胞萎缩、心肌间空隙增大、心肌细胞胞浆溶解、细胞核外流.随着给药剂量增加,现象越严重;高脂饮食加DOX10.0mg/kg组尚观察到心肌间炎细胞浸润的现象.
2体外细胞实验
2.1细胞毒性实验结果
细胞生长曲线显示DOX、OA及PA对HUVECs的毒性具有时间和浓度依赖性.HUVECs在和1μMDOX、150μMOA、100μMPA作用24h时其生存率均高于50%且低于80%,考虑到细胞生长代谢的影响,所以最终选取的给药时间为24h.故在接下来的实验中,我们均选用以上浓度,观察DOX、OA及PA单独或联合应用对HUVECs的损伤作用.联合给药结果显示:DOX1μM+OA150μM或DOX1μM+PA100μM与HUVECs作用24h,与DOX、PA或OA单独应用相比,HUVECs的存活率进一步下降(P<0.05或0.01).
2.2DOX单独或联合应用OA或PA对HUVECs脂质沉积的影响
HUVECs的油红O染色结果显示,Con组、DMSO组细胞内有少许正常量脂质沉积,二者间未见明显差别.DOX组、OA组及PA组的脂质沉积均较DMSO组为重.DOX+OA组、DOX+PA组细胞内脂质沉积量异常增多,伴细胞形态及细胞数量的明显减少.
2.3DOX单独或联合应用OA或PA对HUVECs内活性氧(ROS)水平升高的影响
激光共聚焦显微镜检测结果显示,DOX作用于HUVECs24h后,细胞肿胀伴细胞荧光强度(反映ROS含量)升高(P<0.01),而OA/PA对细胞荧光强度影响不明显,但是DOX与OA/PA联合用药后,细胞内ROS含量升高更加明显,荧光强度较单独DOX、OA、PA组更高(P<0.01).
2.4DOX单独或联合应用OA或PA对HUVECsMDA的影响
DOX、OA、PA、DOX+OA、DOX+PA与Con组、DMSO组相比,使HUVECs裂解液中MDA含量升高.DOX+OA、DOX+PA组MDA含量高于DOX、OA及PA单独使用(P<0.01).
2.5DOX单独或联合应用OA或PA对HUVECsMn-SOD及FABP4mRNA表达的影响
RT-PCR结果显示,与Con组、DMSO组相比,DOX组、OA组、PA组能够使Mn-SOD的mRNA含量下降(P<0.01),DOX与OA/PA联合用药后,使Mn-SOD的mRNA含量下降更低(P<0.01);与Con组、DMSO组相比,DOX组、OA组、PA组FABP4水平无差别,但DOX与OA/PA联合用药后,FABP4的mRNA含量升高(P<0.05).
2.6FABP4单独或联合应用OA或PA对HUVECs内活性氧(ROS)水平的影响
激光共聚焦显微镜检测结果显示,与Con组、DMSO组相比,单独OA/PA组ROS含量、荧光强度无差别,但是FABP4与OA/PA联合用药后细胞内ROS含量荧光强度升高(P<0.01).
结论:
1.整体实验结果表明,DOX可进一步升高高脂饮食的APOE-/-小鼠血液胆固醇水平,加重脂质在动脉沉积致心肌损伤及心功能下降.
2.体外细胞实验表明,DOX与OA/PA联合应用均能使HUVECs的存活率降低,这一作用和其促进脂质沉积、加重氧化应激反应有关.FABP4介导的信号通路可能参与这一反应.
方法:
1整体动物实验
选取7-8周龄的雄性APOE-/-小鼠20只,体重27±2g,随机分为5组,4只/组.分别为正常饮食组(Normal diet)、高脂饮食组(high fat diet),高脂饮食加DOX+2.5mg/kg组、5mg/kg组和10mg/kg组(以下简写为DOX2.5mg/kg、DOX5.0mg/kg、DOX10.0mg/kg).在动物给予高脂饮食一周后,DOX各处理组一次性给予不同剂量的DOX,正常饮食组和单纯高脂饮食组给予等量生理盐水,各组均采用腹腔注射给药,给药容积均为1ml.观察并记录各组动物的每日摄食量,一周左右称重一次,每2周左右测定1次血浆总胆固醇(TC)水平.给予阿霉素后第8周采用小动物超声分析仪检测小鼠心脏射血分数(EF)、缩短分数(FS)、左室等容收缩时间(IVCT)和左室等容舒张时间(IVRT)等指标,并于第9周末最后一次称重后处死小鼠.分离和摘取腹主动脉全长和心脏,用4%多聚甲醛固定过夜,腹主动脉全长采用油红O染色观察主动脉血管内斑块的形成情况,心脏组织采用蔗糖梯度脱水(15%蔗糖24h,30%蔗糖24h)48h后,心房组织(心脏流出道部分)做冰冻切片,OCT包埋,液氮速冻,用冰冻切片机切片,切片厚度为9μm,油红O染色观察心脏流出道内脂质沉积形成情况.心室组织采用HE染色观察心室肌的病变情况.
2体外细胞实验
2.1DOX、OA及PA对HUVECs存活率的影响
体外培养HUVECs,分别给予不同浓度的DOX、OA、PA和细胞作用24h和48h,采用MTT法测定24h及48h各处理组HUVECs的存活率,确定HUVECs存活率为50%~80%的DOX、OA及PA的时间和浓度.之后,采用DOX和OA/PA联合处理细胞,检测其对细胞存活率的影响.
2.2DOX单独或联合应用OA或PA对HUVECs脂质沉积的影响
将处于对数生长期的HUVEC细胞随机分为7组,分别为①Control组(简写:Con组)、②DMSO组、③DOX组、④OA组、⑤PA组、⑥DOX+OA组、⑦DOX+PA组.DOX、OA及PA的浓度分别为1μM、150μM及100μM,将以上各给药组置培养箱中培养24h,油红O染料染色观察各组细胞内脂质沉积情况.
2.3DOX或FABP4单独或联合应用OA或PA对HUVECsROS的影响
培养HUVECs,分组和给药如前,将细胞用活性氧分子(ROS)特异性荧光探针2,7-dichlorofluorescenindiacetate(DCFH-DA)1μM染色30min,激光共聚焦显微镜检测细胞荧光强度,以此反映ROS的含量.
另取一组HUVECs,随机分为5组,分别为①Control组(简写:Con组)、②DMSO组、③OA组、④PA组、⑤FABP4+OA组、⑥FABP4+PA组.FABP4、OA及PA的浓度分别为100ng/ml、150μM及100μM,将以上各给药组的细胞置培养箱中培养24h,用激光共聚焦显微镜检测ROS水平.比较FABP4与OA/PA联合应用对细胞荧光强度的影响.
2.4DOX单独或联合应用OA或PA对HUVECsMDA的影响
培养HUVECs,分组和给药如前,取细胞裂解液,用紫外分光光度计测定蛋白浓度,按MDA试剂盒说明书测定MDA水平.
2.5DOX单独或联合应用OA或PA对HUVECsFABP4和Mn-SODmRNA的影响
培养HUVECs,分组和给药如前,采用RT-PCR法观察HUVECsFABP4和Mn-SOD的mRNA的表达情况.
结果:
1整体动物实验:
1.1动物一般情况
正常饮食组、单纯高脂饮食组动物一般活动、摄食量及体重在整个观察期内均未见异常.而高脂饮食+DOX2.5、5.0组和10.0mg/kg组和单纯高脂饮食组相比,小鼠出现活动量减少、皮毛粗糙及竖毛现象.DOX5.0及10.0mg/kg组36天后动物体重明显减轻(P<0.05或0.01)并持续到整个观察期结束.摄食量各组未见明显差别.
1.2DOX对APOE-/-小鼠心功能的影响
心脏超声结果显示,与正常饮食组相比,APOE-/-小鼠单纯高脂饮食组EF、FS、IVCT和IVRT没有明显差异;与单纯高脂饮食组相比,高脂饮食加DOX5.0、DOX10.0mg/kg组EF和FS明显降低(P<0.01),但是VICT和VIRT没有明显变化.高脂饮食加DOX2.5mg/kg组对上述指标均没有明显影响.
1.3血浆TC的测定结果
给药前,各组动物血浆中的TC水平未见明显差异.给药后第33天、47天及60天,与正常饮食组相比,单纯高脂饮食组小鼠血浆中TC明显升高(P<0.01);与单纯高脂饮食组相比,高脂饮食加DOX2.5、5.0mg/kg组血浆中TC未见明显变化,高脂饮食加DOX10.0mg/kg组血浆中TC明显升高(P<0.05).
1.4DOX对APOE-/-小鼠主动脉斑块形成的影响
正常饮食组主动脉血管只有极少量斑块;单纯高脂饮食组斑块数量、面积大于正常饮食组;高脂饮食+DOX各给药组斑块数量、面积与单纯高脂饮食组有增多的趋势,并且随着剂量的增大,趋势越明显,还伴有动脉血管壁硬化、管腔变小的现象.
1.5DOX对APOE-/-小鼠心脏流出道脂质沉积的影响
正常饮食组心脏流出道部分未见脂质沉积;与正常饮食组相比,单纯高脂饮食组心脏流出道有脂质沉积;与单纯高脂饮食组相比,高脂饮食加DOX给药组心脏流出道脂质沉积更多,并且心脏三尖瓣处均有见脂质沉积.
1.6DOX对APOE-/-小鼠心脏组织病理学影响
小鼠心室肌HE染色显示,APOE-/-小鼠单纯高脂饮食组与正常饮食组相比除心肌间空隙增大外,没有明显变化.但是DOX各给药组与单纯高脂饮食组相比细胞排列紊乱、血管壁增厚、细胞萎缩、心肌间空隙增大、心肌细胞胞浆溶解、细胞核外流.随着给药剂量增加,现象越严重;高脂饮食加DOX10.0mg/kg组尚观察到心肌间炎细胞浸润的现象.
2体外细胞实验
2.1细胞毒性实验结果
细胞生长曲线显示DOX、OA及PA对HUVECs的毒性具有时间和浓度依赖性.HUVECs在和1μMDOX、150μMOA、100μMPA作用24h时其生存率均高于50%且低于80%,考虑到细胞生长代谢的影响,所以最终选取的给药时间为24h.故在接下来的实验中,我们均选用以上浓度,观察DOX、OA及PA单独或联合应用对HUVECs的损伤作用.联合给药结果显示:DOX1μM+OA150μM或DOX1μM+PA100μM与HUVECs作用24h,与DOX、PA或OA单独应用相比,HUVECs的存活率进一步下降(P<0.05或0.01).
2.2DOX单独或联合应用OA或PA对HUVECs脂质沉积的影响
HUVECs的油红O染色结果显示,Con组、DMSO组细胞内有少许正常量脂质沉积,二者间未见明显差别.DOX组、OA组及PA组的脂质沉积均较DMSO组为重.DOX+OA组、DOX+PA组细胞内脂质沉积量异常增多,伴细胞形态及细胞数量的明显减少.
2.3DOX单独或联合应用OA或PA对HUVECs内活性氧(ROS)水平升高的影响
激光共聚焦显微镜检测结果显示,DOX作用于HUVECs24h后,细胞肿胀伴细胞荧光强度(反映ROS含量)升高(P<0.01),而OA/PA对细胞荧光强度影响不明显,但是DOX与OA/PA联合用药后,细胞内ROS含量升高更加明显,荧光强度较单独DOX、OA、PA组更高(P<0.01).
2.4DOX单独或联合应用OA或PA对HUVECsMDA的影响
DOX、OA、PA、DOX+OA、DOX+PA与Con组、DMSO组相比,使HUVECs裂解液中MDA含量升高.DOX+OA、DOX+PA组MDA含量高于DOX、OA及PA单独使用(P<0.01).
2.5DOX单独或联合应用OA或PA对HUVECsMn-SOD及FABP4mRNA表达的影响
RT-PCR结果显示,与Con组、DMSO组相比,DOX组、OA组、PA组能够使Mn-SOD的mRNA含量下降(P<0.01),DOX与OA/PA联合用药后,使Mn-SOD的mRNA含量下降更低(P<0.01);与Con组、DMSO组相比,DOX组、OA组、PA组FABP4水平无差别,但DOX与OA/PA联合用药后,FABP4的mRNA含量升高(P<0.05).
2.6FABP4单独或联合应用OA或PA对HUVECs内活性氧(ROS)水平的影响
激光共聚焦显微镜检测结果显示,与Con组、DMSO组相比,单独OA/PA组ROS含量、荧光强度无差别,但是FABP4与OA/PA联合用药后细胞内ROS含量荧光强度升高(P<0.01).
结论:
1.整体实验结果表明,DOX可进一步升高高脂饮食的APOE-/-小鼠血液胆固醇水平,加重脂质在动脉沉积致心肌损伤及心功能下降.
2.体外细胞实验表明,DOX与OA/PA联合应用均能使HUVECs的存活率降低,这一作用和其促进脂质沉积、加重氧化应激反应有关.FABP4介导的信号通路可能参与这一反应.