目的：富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)越来越受到人们的重视，它可以作为生长因子的来源与骨髓基质干细胞(bone marrow stromalstem cells，BMSCs)一起构建种植体周围组织工程化骨。BMSCs进入成骨分化后，可以作为种子细胞应用于骨组织工程研究中。I型胶原蛋白是成骨细胞分泌的，是组成骨组织结构和形成骨力学强度最基本的基质蛋白。本研究采用体外实验，将由兔全血所制备的PRP作用于其自体BMSCs，探讨自体PRP在不同的时间段对BMSCs增殖及分化能力的影响以及对成骨细胞I型胶原蛋白表达的影响，进一步揭示PRP的作用机制，为临床根据生理和病理的需要，对PRP选择合理的应用时间提供实验依据。方法：①B MSCs的培养：应用全骨髓培养法取兔骨髓基质干细胞(BMSCs)进行原代培养，具体方法为：将2-3月龄新西兰大白兔以戊巴比妥钠经耳缘静脉麻醉，在腿部胫骨平台处以16号骨髓穿刺针垂直骨面，旋转进入骨髓腔，抽取4-6ml骨髓接种于培养瓶，待细胞达到70~80％贴壁融合后予以传代，用倒置显微镜观察原代及传代细胞形态。②绘制细胞生长曲线：于1-10d每日将接种于24孔板内的第三代BMSCs各取3孔，胰蛋白酶消化后置于倒置显微镜下计数，绘制细胞生长曲线。③P RP的制备：采用二次离心法分离兔全血制备PRP，仪器计数法获得全血与PRP中的血小板数目。具体步骤为：麻醉实验动物后，分离颈动脉，抽取全血约100ml，第一次先以1100r/min速度室温离心10min，吸取全部上清液及红细胞液面下1-2mm液体，再以2200r/min的速度室温离心10min，弃2/3上清液，所剩1/3液体即为PRP。新鲜获取的PRP以牛凝血酶激活后，立即加入到细胞培养系中。④成骨细胞的鉴定：取第3代生长良好的BMSCs用成骨诱导培养液进行培养后，在特定的时间以碱性磷酸酶染色法及钙结节茜素红染色法验证其成骨分化能力。⑤实验分组：实验组加入含20％PRP的含矿化诱导液的无血清完全DMEM培养液；对照组加入不含PRP的含矿化诱导液的无血清完全DMEM培养液；空白对照组只加入无血清完全DMEM培养液。各组设三复孔。⑥成骨细胞增殖检测：MTT法检测增殖，分别在第1、4、7、10d弃去实验组和对照组孔内培养液，加入MTT试剂，37℃孵育4h，再加入二甲基亚砜，结晶均匀溶解后在酶标仪上测各标本的OD值。⑦成骨细胞碱性磷酸酶活性检测：分别在第4、7、10、14d检测实验组和对照组细胞中碱性磷酸酶的含量，遵照碱性磷酸酶检测试剂盒步骤操作。⑧成骨细胞I型胶原蛋白表达检测：分别第在4、9、14、19、24d通过蛋白质印迹法（Western-blot）检测实验组和对照组成骨细胞中I型胶原蛋白的表达水平。结果：①倒置显微镜下细胞形态：原代BMSCs培养2～3d后呈多角形、椭圆形或短梭形，至12d左右可达到80％融合，此时典型的细胞形态为均一的细长梭形、纺锤形或平行状排列，胞体较前小，细胞外基质增多，细胞边界不甚清晰，突起更为明显，呈集束状、鱼群样或漩涡状排列，传代后的细胞形态比原代细胞更为均一，增殖更迅速。细胞的生长曲线显示：1-2d为潜伏期，细胞增殖不明显，3天后细胞增殖明显加快，进入对数生长期，8天后增殖变慢为平台期，之后细胞数目趋于平缓。②成骨细胞的鉴定：碱性磷酸酶染色和钙结节茜素红染色结果均呈阳性表达，经成骨诱导后，第10d碱性磷酸酶染色结果显示细胞核呈蓝紫色，细胞胞浆中出现红棕色、棕褐色或咖啡色颗粒，第14d钙结节茜素红染色显示结节处有橘红色钙盐沉积，即为钙化结节，表明所培养的BMSCs具备成骨分化能力，可诱导为成骨细胞，并具有矿化能力。③PRP的检测：采用二次离心法制备的PRP中的血小板数目为869±29×109/L，是全血中血小板数目的4.2倍（全血为207±41×109/L）。④MTT检测增殖结果：实验组各时间点均明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），且在第7d时实验组获得最高OD值，对照组各时间点之间无明显变化。因此，成骨细胞的增殖与PRP存在时间效应。⑤碱性磷酸酶活性检测：实验组各时间点均明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），且在第10d时实验组获得最高OD值，对照组各时间点之间无明显变化。因此，BMSCs的分化与PRP存在时间效应。⑥I型胶原蛋白的表达量的测定：实验组各时间点蛋白表达灰度值均高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），且在第9d时实验组I型胶原蛋白的表达灰度值达到峰值。因此，成骨细胞I型胶原蛋白的表达水平与PRP存在时间效应。结论：①20％PRP能有效地促进BMSCs的增殖，且在第7d时促进增殖作用最强。②采用二次离心法制备的PRP可含有高浓度的生长因子，20％PRP能有效的促进成骨细胞ALP的表达，且第10d时作用最强。③20％PRP能显著地提高成骨细胞I型胶原蛋白的表达水平，且第9d时表达水平最高。